红景天注射液的提取与精制工艺研究

amy54321

     作者：杨婷媛 李三鸣 刘洪卓 姚慧敏 李红菊

【关键词】  红景天注射液 提取 精制 红景天苷 酪醇

　　Abstract：ObjectiveTo study the extraction and purification process of Hongjingtian Injection. MethodsAn orthogonal method was adopted to optimize the extraction and purification process with the transference rate of Salidroside and p-Tyrosol as criterion. ResultsThe optimized process of extraction was that eight times water as extracted solvent, the comminuted medical material was extracted three times，each for an hour. Alcohol precipitation method and gel flocculating method were both used to optimize purification process. Alcohol precipitated concentration was 70%. The optimized process of gel flocculating method was that the extracted solution was condensed to 0.5g·ml-1 (equivalent to raw materia1) and its pH was adjusted to 5.0. The 5.0% gelatin solution was added into the condensed solution with agitation rate of 60 r·min-1 at 60℃ until there was no more precipitation. ConclusionThe results of impurity test meet the standard for injection. The established methods can be used for extraction and purification of Hongjingtian injection.

　　Key words：Hongjingtian Injection;  Extraction;  Purification;  Salidroside;  P-Tyrosol
   
　　红景天为景天科植物红景天的干燥根和根茎，性寒，味微苦、涩，临床上常以水煎入药，具有清热解毒、活血化淤之功效。现代研究表明，红景天对心脑血管疾病具有很强的治疗作用，且无明显的毒副作用，有着极好的应用前景。中药输液与小针剂相比，在不溶性微粒控制、有关物质检查、提高有效成分分析方法检测方面均具有更高的灵敏度与准确度，同时又避免了小针剂配伍中可能引起的不良反应，虽然在制剂难度上很大，但在临床使用的安全有效性和产品的可控性等方面却都起到了“质”的变化［1］。红景天苷和酪醇［2,3］是红景天中已知的两种活性成分，本文以红景天苷和酪醇的总转移率为指标，对红景天注射液的提取与精制工艺进行研究。

　　1  仪器与试药
   
　　LC-10ATVP高效液相色谱仪，日本岛津株氏会社；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；微型植物试样粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂。
   
　　红景天，产地西藏；红景天苷对照品，购自中国药品生物制品检验所；酪醇对照品，购自日本；乙腈、甲醇均为色谱纯；水为二次蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  红景天苷和酪醇的HPLC分析条件 色谱柱：ODS(Kromasil C18，250 mm×4.6 mm，5 μm，天津科技仪器有限公司)；流动相为甲醇-乙腈-0.06%磷酸（10∶10∶80,v/v/v），流速1.0 ml·min-1，检测波长275 nm，进样量20 μl。

　　2.2  提取工艺的研究

　　2.2.1  提取溶剂的选择考察了以水和不同浓度的乙醇作为提取溶剂，结果表明提取效果并没有显著差异，所以确定为以水作为提取溶剂。

　　2.2.2  提取工艺的优化取粉碎后的红景天药材9份，以溶剂用量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）这3个工艺参数为考察因素，每个因素选择3个水平(见表1)。按照L9（34）正交实验表进行实验，以测出的红景天苷和酪醇的总转移率为评价指标,筛选最佳工艺条件。结果见表2。

　　表1  提取的因素与水平（略）

　　根据极差分析，结果表明溶剂用量和提取次数对红景天苷和酪醇的总转移率有显著影响，而提取时间对结果无显著影响。综合考虑，确定最佳提取工艺为A2B1C3，即将粉碎的红景天药材，用8倍量的水，加热回流提取3次，提取1 h/次。

　　2.3  精制工艺的考察及优化影响中药注射剂稳定性和安全性的杂质主要有蛋白质（Protein）、草酸盐（0xalate）、钾离子（K+）、鞣质（Tannin）和树脂（Resin）依次采用磺基水杨酸沉淀法、氯化钙沉淀法、四苯硼酸钠沉淀法、蛋清沉淀法、盐酸沉淀法进行检查。　表2  正交实验的结果（略）

　　2.3.1  醇沉法取浓缩后的水提取液，加95%的乙醇，调醇浓度至70%，冷藏24 h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩，测定红景天苷和酪醇的含量，计算总转移率，并对醇沉后的样品进行各杂质检查。结果见表3。

　　表3  杂质检查的结果（略）

　　“（－）”指结果显阴性；“（＋）”指结果显阳性
   
　　醇沉前的总转移率为73.52%，醇沉后的总转移率为68.52%，这一结果表明醇沉法对红景天苷和酪醇的含量影响较小；醇沉后提取液中不含有蛋白质、草酸盐、钾离子和树脂，但仍有鞣质存在。

　　2.3.2  明胶法目前除去药液中鞣质的方法有碱性醇沉淀法、热处理冷藏法、明胶法和壳聚糖絮凝法等［4］，本文采用明胶法，作为除鞣质的方法，并对其影响因素进行正交实验考察，以确定最优工艺。
   
　　取醇沉后的提取液9份，以浓缩比例（A）、控制温度（B）、pH值（C）和搅拌速度（D）这4个工艺参数为考察因素，每个因素选择3个水平。见表4，按照L9（34）正交实验表进行实验，每份加5%明胶溶液至不再生成沉淀时为止，冷藏24 h，滤过，浓缩，用95%乙醇调醇浓度至85%，冷藏24 h，滤过，浓缩，测定红景天苷和酪醇的含量，并进行鞣质、蛋白质检查。结果见表5。

　　表4  明胶法的因素与水平（略）

　　各组的鞣质检查和蛋白质检查均呈阴性，说明鞣质已被除去，过量的明胶也已被除去。根据极差分析，结果表明，浓缩比例和pH值对总转移率有显著性影响，温度和搅拌速度对总转移率影响并不大，只是当温度较高，转速较大时，沉淀的沉降速率较快，所以，确定最佳纯化工艺为A2B3C3D3 ，即将醇沉后的药液比为1∶2，即0.5 g·ml-1 (相当于原生药)，调pH值至5.0，在60℃，转速为60 r·min-1的条件下，加入5%明胶溶液至不再生成沉淀时为止。

　　2.4  最佳提取纯化方案及结果取粉碎后的红景天药材，加8倍量水加热回流提取3次，提取1 h/次，药液滤过，减压浓缩，加95%乙醇，调醇浓度至70%，搅匀，冷藏24 h，滤过，减压浓缩，加水至浓度为0.5 g·ml-1 (相当于原生药)的溶液，调pH至5.0，在60℃，转速为60 r·min-1的条件下，加入5%明胶溶液至不再生成沉淀时为止，冷藏24 h，滤过，浓缩，加95%乙醇，调醇浓度至85%，冷藏24 h，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.30的浸膏，即得。对浸膏进行薄层鉴别，含量测定及杂质检查。结果见表6～7。

　　表5  明胶法正交实验的结果（略）

　　表6  浸膏含量测定的结果（略）

　　表7  杂质检查的结果（略）

　　采用薄层色谱法对红景天浸膏中的红景天苷和酪醇进行鉴别，可知浸膏与对照品红景天苷和酪醇在相同位置上显示同样颜色的斑点。结果表明，采用上述提取精制方法，在保留了红景天中有效成分红景天苷和酪醇的同时，可有效地去除蛋白质、草酸盐、钾离子、鞣质和树脂等杂质，且红景天苷和酪醇的总转移率较高，所制得的红景天浸膏，可用于红景天注射液的下一步制备。

　　3  讨论
   
　　红景天中的有效成分红景天苷和酪醇等，均为醇水双溶性成分，本文考察了以水和不同浓度的乙醇作为提取溶剂，结果表明提取效果并没有显著差异，考虑到工业生产的安全因素与经济因素，故采用水作为提取溶剂。
   
　　从实验结果可以看出，醇沉法仍是中药制剂纯化中切实可行的方法，应用较多。影响中药注射剂澄明度的主要因素是由于鞣质的存在，本文采用明胶法去除鞣质，明胶法是使鞣质在酸性水溶液中和蛋白质结合成鞣酸蛋白形成沉淀，滤过去除鞣质，再将滤液浓缩后加乙醇使溶液醇浓度升高，过量的明胶在高浓度乙醇溶液中析出，静置，滤过，除去过量明胶。
   
　　从薄层鉴别、含量测定和杂质检查的实验结果表明，本文所采用的提取精制方法，在保留了红景天中有效成分红景天苷和酪醇的同时，还有效地去除了影响中药注射剂稳定性和安全性的杂质，且使红景天苷和酪醇具有较高的转移率，该方法简便、可靠，适应于工业生产。

【参考文献】
  　　［1］ 陈秋潮.从安全用药角度看发展中药注射液剂的必要性［J］.上海医药，2005，26（4）:149.

　　［2］ 郑占虎.中药现代研究与应用［M］.北京:学苑出版社，5658.

　　［3］ 中国科学院中国植物杂志编委会.中国植物杂志,第1分册［M］.北京：科学出版社,1984，34:161.

　　［4］ 王 健，徐自升，毛宏亮.中药注射液中鞣质去除方法的探讨［J］.基层中药杂志，2001，15（5）:51.