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作者：岳云飞 王振月 王谦博
【摘要】 目的采用柱前衍生法测定毛脉酸模根中氨基酸的含量。方法利用柱前衍生反相高效液相色谱（RPHPLC）法测定毛脉酸模根中16种氨基酸。采用DikmaC18色谱柱；流动相：A为0.05 mol/L乙酸钠溶液中含1%N,N二甲基甲酰胺，B为乙腈水（1∶1），梯度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长360 nm；柱温40℃。结果氨基酸的摩尔浓度与峰面积成良好的线性关系，r均在0.999以上； 16种氨基酸的回收率为94.7%～112.9%。结论该方法准确、重现性好，可用于毛脉酸模根中氨基酸的含量测定。
【关键词】 毛脉酸模 氨基酸 高效液相色谱法
Abstract:ObjectiveTo determine the amino acids in root of Rumex gmelini with precolumn derivatization. MethodsSixteen kinds of amino acids were determined in root of Rumex gmelini by pre-column of RPHPLC. HPLC analysis was performed on Dikma C18 column with mixture of 0.05mol/L sodium acetate to contain 1% N,N-dimethylformamide (A) and acetonitrile-water (1∶1) (B) as mobile phase in gradient mode. The flow rate was 1.0ml/min. The detection wavelength was 360nm and the column temperature was 40℃. ResultsThe molar concentrations of amino acids and peak areas achieved a nice linear relationship (r was higher than 0.999). The recoveries of sixteen kinds of amino acids were 94.7%～112.9%. ConclusionThe method is accurate and repeatable for the determination of amino acids in Rumex gmelini.
Key words:Rumex gmelini; Amino acids; HPLC
毛脉酸模Rumex gmelini Turcz.为蓼科（Polyonaceae）酸模属多年生宿根草本植物，广泛分布于黑龙江省大小兴安岭及张广才岭等地区，是黑龙江省、吉林长白山地区的重要药用资源植物。以根入药，味甘，性寒，有清热解毒、凉血止血、通便利尿之功，民间以治疗癣病或止血著称［1,2］。 化学成分研究表明，毛脉酸模根中含有白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚及酸模素等多种化合物［3～5］，具有抗真菌、抗肿瘤、镇咳祛痰、平喘降压、抗病毒和抗氧化等作用［6～8］。因此，毛脉酸模有重要的开发价值。
氨基酸是植物中的重要有效成分。研究表明，氨基酸有抗心血管、衍生物有抗肿瘤等作用［9］。近年来开始对人参、田七等植物药中的氨基酸进行了研究［10］，但对毛脉酸模中的氨基酸的分析还未见报道过。本实验以2年生和3年生毛脉酸模为研究对象，采用高效液相色谱法对毛脉酸模根中的氨基酸进行测定，以期为毛脉酸模的开发利用提供理论依据。
1 仪器与材料
Agilent-1100高效液相色谱仪，色谱柱为Dikma C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），Mettler 电子天平AE 240（瑞士），DIKMA 微孔滤膜（0.45 μm），ZK82B型真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）。
门冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸 （Try）购于Agilent公司；甲醇、乙腈为美国Dikma公司产品，色谱纯；水为自制重蒸水；其余均为分析纯。样品于20041001采自黑龙江中医药大学药用植物园（所有样品均由黑龙江中医药大学药学院中药资源与开发教研室王振月教授鉴定）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为DikmaC18柱；流动相：A：0.05 mol/L乙酸钠溶液中含1%N,N二甲基甲酰胺，B：乙腈水（1∶1），流动相梯度洗脱程序见表1；柱温40℃；流速1.0 ml/min；检测波长360 nm；进样量：对照品溶液进样20 μl；供试品溶液进样50 μl。
表1 流动相梯度洗脱程序（略）
2.2 供试品溶液的制备 将采集后的样品置40℃干燥后，粉碎成粉末（过80目筛），精密称取粉末0.2 g，置索氏提取器中，以50%乙醇为溶剂回流4 h，提取液回收至干，残渣用水溶解，过滤，滤渣和滤器用水洗涤，将滤液和洗液合并，用水定容至10 ml，作为供试品溶液。
2.3 供试品的衍生 取供试品1.0 ml，加入0.5 mol/L碳酸钠缓冲液（以0.5 mol/L碳酸钠调0.5 mol/L碳酸氢钠置pH为9.0）1.0 ml和1%的2,4－二硝基氟苯的乙腈溶液1.0 ml，摇匀，60℃水浴暗处放置60 min，取出冷却后，加入磷酸盐缓冲液（pH7.0）10 ml，摇匀，过0.45 μm的滤膜。
2.4 对照品溶液的制备 取Agilent公司提供的对照品溶液，分别制备成浓度为25，100 ，250 ，500 ，1000 pmol/μl的对照品溶液，按2.3项下衍生后进样20 μl，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标作曲线（见表2）。样品和标准品的色谱图见图1。
表2 16种氨基酸的标准曲线（略）
图1 毛脉酸模样品（a）和氨基酸混合标准溶液（b）的HPLC图（略）
2.5 精密度实验 用氨基酸混合标准品溶液做6次平行实验，结果16种氨基酸的RSD均小于5%。表明精密度良好。
2.6 稳定性实验 取毛脉酸模根的粉末0.2 g 1份。按2.2项，2.3项下制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10 h进样，结果16种氨基酸的RSD均小于5%。表明样品在10 h内稳定性良好。 2.7 加样回收率实验 采用单点和多点加入法将各氨基酸标准品溶液定量加入样品溶液中，进行试验，结果各种氨基酸的回收率为94.7%～112.9%。
2.8 样品测定 按2.2，2.3项下制备供试品溶液，进样50 μl。16种氨基酸含量测定结果见表3。从表中可知，16种氨基酸都存在于毛脉酸模的样品中，精氨酸含量最高，而赖氨酸含量最低。其余的氨基酸的含量都在0.01%～0.09%之间。在16种氨基酸中有7种是人体必需的氨基酸，其总量为0.254 2%，约占氨基酸总量的30.41%。
表3 16种氨基酸含量及总量的测定结果（略）
*人体必需氨基酸；∑ 氨基酸总量；∑*人体必需氨基酸总量
3 讨论
样品衍生时应严格控制衍生的时间，保证衍生时间的充足；pH值对衍生有重要的影响，衍生时也应严格控制衍生的pH值；另外温度不可过低，否则将造成衍生不完全。本法流动相中含有盐，应控制柱温（最好为40℃），柱温不可过低，过低将易导致流动相中出现结晶，堵塞色谱柱，产生柱压过高等现象。
氨基酸是植物中重要的有效成分，其中谷氨酸可促进人体内消化液的分泌，具有预防贫血及解毒作用；精氨酸可控制体内细胞的退化；胱氨酸是毛发的成分，具有促进毛发生长和防止皮肤老化作用，也可用于抗过敏、肝炎、白血球减少等症；苏氨酸在人体内有转变氨基酸达到平衡的作用。正确地利用这些氨基酸，是充分发挥毛脉酸模药用价值的重要因素之一。
【参考文献】
［1］ 刘慎谭. 东北草本植物志, 第2卷［M］.北京：科学出版社，1959：24.
［2］ 吉林省中医中药研究所. 长白山植物药志［M］.吉林：人民出版社, 1982：299.
［3］ 王振月, 李延冰, 匡海学, 等. 毛脉酸模中大黄酚、大黄素的分离鉴定［J］.中医药学报, 1996 , 24(2)：54.
［4］ 王振月, 蔡学勤, 康毅华, 等. 毛脉酸模中两个化合物的结构研究［J］.中草药, 1996, 27 (12)：714.
［5］ 闫 静, 王振月, 刘丹宁, 等. 白藜芦醇及其甙的生物活性研究进展［J］.中医药学报, 2000, 28 (2)：39.
［6］ 郑水庆 , 陈万生 , 曾 明 , 等. 酸模属药用植物的资源利用研究概况［J］.药学实践杂志 , 2000 , 18(5): 347.
［7］ Schneider Y , Vincent F , et al. Anti-proliferative effect of resveratrol , a natural component of grapes and wine on human colonic cancer cells［J］.Cancer Letters , 2000 , 158(1)：85.
［8］ 冯长根, 赵 军, 刘 霞. 马齿苋治疗心血管疾病的研究进展［J］. 中药材, 2004, 27(12)：955.
［9］ 陈 黎, 吴 卫, 郑有良. 鱼腥草游离氨基酸组成及含量的HPLC分析［J］.氨基酸和生物资源, 2004, 26 (1): 20.
［10］ 陈志慧. 氨基酸分析技术的综述［J］.广东化工, 2004, 2：69. |
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发表于 2014-8-19 18:20:18
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