双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨生物力学和生化指标的影响

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【摘要】  目的观察双丹口服液对环磷酰胺造成大鼠的骨质疏松模型的影响。方法用4.5 mg·kg-1·d-1的环磷酰胺灌胃给大鼠，连续15 d，造成大鼠骨质疏松模型；用双丹口服液进行预防给药，并与阳性药物碳酸钙维D比较。实验结束后，取大鼠右侧股骨进行骨生物力学检测，随后检测骨钙、磷、镁和羟脯氨酸含量。结果环磷酰胺明显导致大鼠股骨的骨有机质与矿物质丢失，生物力学性能下降，双丹口服液可有效地拮抗这些作用，且效果与碳酸钙维D相当。结论双丹口服液可有效预防环磷酰胺所引起的大鼠股骨的骨丢失及骨质量下降。

【关键词】  双丹口服液 环磷酰胺 碳酸钙维D 大鼠 骨矿物质 骨生物力学

　　Abstract:ObjectiveTo study osteoporosis of cyclophosphamide and investigate the preventive effects of Shuangdan oral liquid on rats.MethodsCyclophosphamide at the dose of 4.5 mg·kg-1·d-1 was given to the rats orally for 15 days while Shuangdan oral liquid and calcium and vitamin D3 were given to cyclophosphamide-treated rats orally. At the experiment, bone biomechanics analysis of the right femur were performed in fresh sections. Then the hydroxyproline, Ca, P, Mg of bone were tested.ResultsBiomechanics property and bone mineral on femur of rats decreased significantly.ConclusionShuangdan oral liquid can prevent osteopathologic change from cyclophosphamide-induced on rats.

　　Key words:Shuangdan oral liquid;   Cyclophosphamide;   Calcium and vitamin D3;  Rats;   Bone mineral;   Bone biomechanics
   
　　双丹口服液记载于2005版《中国药典》，由丹参和牡丹皮两味中药组成，是著名的中药方剂。已有报道双丹口服液具有清除氧自由基，改善血流循环，增强免疫，以及抗炎、抗肿瘤等作用。其有效成分包括丹参素、丹参酮、丹皮酚、芍药苷等，本课题组曾报道丹参素能提高成骨细胞的活性，防治糖皮质激素大鼠所致的骨质疏松［1］，还报道了环磷酰胺可导致大鼠和小鼠产生骨质疏松毒性［2，3］，发现环磷酰胺有抑制成骨细胞活性而导致骨丢失的作用，对骨的影响皆类似于老年型骨质疏松的病理改变。本实验观察双丹口服液对环磷酰胺介导的骨质疏松大鼠股骨的影响，并与阳性药物碳酸钙维D进行比较。现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  药品与试剂

　　1.1.1  药品 丹参、牡丹皮等中药材购自本地药房，产地为四川。环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：403501。碳酸钙维D片：美国安士制药公司，批号：5B16656，每片相当于钙300mg,VitD100单位。

　　1.1.2  试剂 丹参素标准品：中国药品生物制品检定所，批号110855-200304；甲醇（色谱纯，天津四友化学试剂公司）；水为三蒸水；冰醋酸（分析纯，汕头陇西化工厂）；羟脯氨酸试剂盒（碱水解法，南京建成生物技术有限公司）。

　　1.2  仪器  AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司生产)，高效液相色谱仪：Agilent1100系列四元梯度泵、Agilent1100手动进样器, Agilent1100系列一极管阵列检测器, Agilent1100工作站( Agilent公司);超声波清洗器，858 Mini Bionix 型材料测试系统（MTS,USA）；电感偶合等离子体发射光谱仪（ICP,美国TJA公司）；UV-752紫外分光光度计（上海第三医学仪器厂）。

　　1.3   方法

　　1.3.1  药物制备双丹口服液的制备工艺：参照2005年版《中国药典》的方法提取，取丹参600 g，牡丹皮300 g，牡丹皮蒸馏，收集蒸馏液。药渣和丹参加水煎煮两次，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15的清膏，加乙醇使含醇量达60%，冷藏24 h，滤过，滤液回收乙醇至相对密度1.15的清膏，加入牡丹皮蒸馏液，最后将提取液浓缩至每100 ml含生药191.7 g，密封消毒,4℃冰箱保存备用。
   
　　双丹口服液的质量控制：双丹口服液的指纹图谱用高效液相法检测，色谱柱：Agilient C18（250 mm×4.65 mm，5 μm）;流动相：甲醇(A)－1％冰醋酸（B）,程序梯度洗脱：10%A(5 min)-30%A(15min)；流速：1ml/min；温度为室温；检测波长：280 nm。精密称取0.104，0.208，0.312，0.520，0.624，0.728 mg的丹参素钠标准品用三蒸水定容至5 ml，分别精密吸取上述对照品20 μl注入液相色谱仪,记录色谱图,以峰面积对丹参素溶液浓度(μg/ml)进行线性回归计算,得线性回归方程：Y＝11 981X+11.492（r=0.999 9）。再根据指纹图谱中丹参素的峰面积，计算双丹口服液每毫升的丹参素含量。

　　1.3.2  动物与分组 3月龄大鼠40只，雌雄各半，体重（208±28）g，由广东医学院实验动物中心提供，SPF级，动物合格证号：2005A023。按体重对等原则随即分成4组，每组10只。正常对照组: 灌胃给予5 ml·kg-1·d-1生理盐水；环磷酰胺组: 灌胃给予环磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1；碳酸钙维D组：灌胃给予环磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1及碳酸钙维D 0.4 mg·kg-1·d-1；双丹预防组：灌胃给予环磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1及双丹口服液5 mg·kg-1·d-1。4组动物均自由饮水和进食标准饲料。实验共给药15 d，实验结束时，取右侧股骨用生理盐水纱布、锡纸包裹于-20℃保存，待骨生物力学检测及骨有机质和矿物含量检测。

　　1.3.3  骨生物力学检测［4］ 检测时，将-20℃保存的股骨常温解冻，生理盐水复湿。用858 Mini Bionix型材料测试系统监测和分析大鼠右侧股骨的生物力学性能。将股骨置于流变仪上进行三点弯曲实验，加载速度为0.01 mm/s，跨距为15 mm。记录应力-应变曲线，从曲线上读取及计算弹性强度、最大强度、断裂强度、刚性系数、弯曲能量及断裂能量吸收等指标。

　　1.3.4  骨有机质和矿物含量检测 将生物力学检测后的骨材料80℃烘干至恒重,用AE240电子天平称重;然后,每份骨样本加6 mol/L HCl在108℃温度下消化16 h后,把消化液分成两份。一份稀释后用ICP测定骨Ca，P，微量元素的含量,与骨干重进行比较,用骨矿物元素量(mg)/骨干重(g)的比值来作为骨矿物质含量的指标,骨矿物元素量/骨干重的比值越大,说明骨矿物质在骨中所占的比例越大。另一份消化液过滤后调pH值至6,然后,经《中国药典》法测定羟脯氨酸吸光度,在标准曲线中读出其含量。由于骨有机质中骨胶原占90%以上，骨胶原中羟脯氨酸含量比较稳定,约占12.5%，因此,根据骨羟脯氨酸的含量可推算出骨有机质的相对含量。即骨有机质=骨羟脯氨酸/12.5%/90%。用骨有机质/骨干重的比值作为骨有机质含量的指标。其比值越大,说明骨有机质含量越高。

　　1.3.5  数据处理 参数值用(±s)表示，用SPSS12.0进行方差分析。用变化率表示各实验组大鼠相对参数的变化〔如：变化率A=(待比较组/A组-1)×100%〕。

　　2  结果

　　2.1  双丹口服液的制备及质量控制根据1.3.1项方法制备了供实验用的双丹口服液，用高效液相色谱仪检测得到的指纹图谱见图1，丹参素标准品的图谱见图2。经检测及计算，双丹口服液每毫升含丹参素2.431 09 mg。

　　图1  双丹口服液的高效液相指纹图谱（略）

　　图2  丹参素标准品的高效液相质量控制图谱（略）

　　2.2  双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨生物力学指标的影响 结果见表1。

　　表1  双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨生物力学的影响（略）

　　n=10;A、B C为变化率:A是与对照组比较；B是与环磷酰胺模型组比较;C是与碳酸钙维D组比较；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
   
　　由表1可见，环磷酰胺组大鼠股骨的一系列生物力学性能均较正常大鼠呈下降趋势，其中最大强度、刚性系数的差别具有显著性，且斜型断裂面明显多于正常和药物组大鼠；提示环磷酰胺可使大鼠股骨的生物力学性能明显减弱，易产生粉碎性骨折。阳性药物碳酸钙维D组的生物力学性能指标除断裂吸收能量外，均较环磷酰胺组大鼠显著性增加，且与正常大鼠相当；提示碳酸钙维D可有效拮抗环磷酰胺造成的大鼠生物力学性能下降。双丹预防组生物力学性能指标的改变均同阳性药物一致，且数值与阳性药物相当，提示双丹口服液亦可有效拮抗环磷酰胺造成的大鼠生物力学性能下降，其作用效果与阳性药物相当。

　　2.3  双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨骨代谢生化指标的影响 结果见表2。

　　表2  双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨有机质和骨矿含量的影响（略）

　　n=10；A，B， C为变化率：A是与对照组比较,B是与环磷酰胺模型组比较；C是与碳酸钙维D组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
   
　　由表2可见，环磷酰胺使大鼠股骨骨有机质/骨干重以及钙、磷、镁三项骨矿物指数均较正常大鼠显著下降，且差别均有统计学意义（P<0.05）。提示环磷酰胺可使大鼠股骨的骨有机质和骨矿物明显丢失。碳酸钙维D组的上述4项指标均较环磷酰胺组大鼠显著上升，且骨有机质较正常大鼠仍有明显增加，提示碳酸钙维D可有效预防环磷酰胺造成的大鼠骨丢失，特别是骨胶原丢失。而双丹预防组的上述4项指标的改变与阳性药物组一致，提示双丹口服液亦可有效对抗环磷酰胺所介导的大鼠股骨骨丢失作用。

　　3  讨论

　　3.1  双丹口服液制备工艺稳定，质量可控双丹口服液的制备工艺是依据2005版《中国药典》所记载的双丹口服液的方法进行提取制备，该方法对丹参和牡丹皮分别采用针对其药材成分特点的提取步骤，有利于药材成分的有效提取。而本试验所使用的质量控制方法，其流动相采用了梯度洗脱，较药典的固定洗脱更有利于色谱峰的分离。且在标准品的制备上考虑到丹参素为水溶性成分，双丹口服液也为水相提取，因而改用三蒸水溶解。检验结果显示每毫升双丹口服液含丹参素2.431 09 mg，符合《中国药典》工艺的质量控制标准。但丹参素并不一定是双丹口服液中唯一对抗骨丢失的有效成分，故其与骨质疏松的谱效关系有待进一步地研究完善。

　　3.2  环磷酰胺可致大鼠股骨骨生物力学性能下降，双丹口服液有预防作用股骨是大鼠主要的承力组织，其骨干包围着厚而致密的骨密质，坚硬牢固，抗冲击力强。本实验采用三点弯曲法来研究股骨的材料和结构力学特性。结果显示，环磷酰胺可导致正常大鼠的一系列生物力学指标呈现下降趋势，其中表示抗骨能力的最大强度以及代表骨材料硬度的刚性系数分别下降14.8%，27.7%（P<0.05），且断裂面多为斜型。提示环磷酰胺可使大鼠股骨硬度降低，脆性增加，易产生粉碎性骨折。
   
　　补充钙与维生素D是各类骨质疏松的基础治疗，可有效促进骨形成和抑制骨吸收，从而提高骨骼结构性能，降低骨折风险的目的。本实验的结果也显示，碳酸钙维D除能显著对抗环磷酰胺导致的最大强度和刚性系数下降之外，还能使抗变形能力的弹性强度和弯曲能量，抗断裂能力的断裂强度以及代表骨材料可塑性的断裂应变等一系列力学指标呈现显著性上升，说明碳酸钙维D可有效对抗环磷酰胺所导致大鼠股骨的生物力学性能下降，减少骨折发生的可能，与其作为骨质疏松基础治疗药物的作用一致。　双丹预防组的上述性能指标改变均与阳性药物的影响一致，说明双丹口服液同碳酸钙维D一样具有对抗环磷酰胺大鼠股骨的生物力学性能下降的作用，并可有效降低骨折的发生。可能与双丹口服液基础药材的有效成分［5，6］能改善血流微循环，减轻化疗对骨髓的损伤及丹参抑制血管异位钙化,使钙沉积到骨骼［7］，从而促进骨重建和骨矿化等作用有关。
　　3.3  双丹口服液对环磷酰胺致大鼠股骨和腰椎骨矿物质丢失的拮抗作用钙、磷等无机矿物质主要通过骨矿化作用储存沉积于骨骼中，而成骨细胞分泌Ⅰ型胶原相互交联形成间隙为0.5 nm的骨基质框架是骨矿化发生的特定环境。实验结果显示，环磷酰胺组大鼠股骨和腰椎骨的钙、磷、镁均明显丢失，提示环磷酰胺可使大鼠骨骼的骨矿物质丢失。碳酸钙维D组的骨有机质和骨矿物质均较环磷酰胺组明显增加，提示碳酸钙维D可有效拮抗环磷酰胺大鼠的骨丢失作用，其可能与维生素D可增加肠道对钙、磷的吸收利用，以及促进骨胶原的形成矿化作用有关。而双丹预防组对骨有机质和矿物质的影响与阳性药物一致，说明双丹口服液也可有效拮抗环磷酰胺所引起的骨丢失作用。其可能原因：环磷酰胺所致的高浓度超氧自由基是造成骨髓损伤的主要机制之一［8］，自由基的大量沉积，势必将造成骨基质框架结构的破坏，使骨中矿物质沉积减少而导致骨钙、磷、镁的流失。双丹药材［6，9］的有效成分均具有明显清除氧自由基的作用，拮抗对成骨细胞的损伤，有效地对抗自由基大量沉积而造成的骨矿物在骨基质中的矿化沉积减少。
   
　　环磷酰胺致大鼠骨质疏松主要通过抑制骨形成［2］，该模型的特点是骨矿物的丢失，骨质变得薄而易碎，锥体易压缩变形，骨折风险率显著增高，对骨的病理改变类似于老年性骨质疏松的特点。碳酸钙维D因其具有增强骨形成和降低骨吸收的作用，从而被临床广泛用于治疗各型骨质疏松的基础药物。而在本实验中双丹口服液表现出与碳酸钙维D相当的对抗环磷酰胺大鼠的骨丢失及骨生物力学性能下降的作用。提示双丹口服液可能成为临床抗骨质疏松的骨形成促进剂和用于治疗老年性骨质疏松的有效药物。

【参考文献】
  　　Abstract:ObjectiveTo study osteoporosis of cyclophosphamide and investigate the preventive effects of Shuangdan oral liquid on rats.MethodsCyclophosphamide at the dose of 4.5 mg·kg-1·d-1 was given to the rats orally for 15 days while Shuangdan oral liquid and calcium and vitamin D3 were given to cyclophosphamide-treated rats orally. At the experiment, bone biomechanics analysis of the right femur were performed in fresh sections. Then the hydroxyproline, Ca, P, Mg of bone were tested.ResultsBiomechanics property and bone mineral on femur of rats decreased significantly.ConclusionShuangdan oral liquid can prevent osteopathologic change from cyclophosphamide-induced on rats.

　　Key words:Shuangdan oral liquid; Cyclophosphamide; Calcium and vitamin D3; Rats; Bone mineral; Bone biomechanics

　　双丹口服液记载于2005版《中国药典》，由丹参和牡丹皮两味中药组成，是著名的中药方剂。已有报道双丹口服液具有清除氧自由基，改善血流循环，增强免疫，以及抗炎、抗肿瘤等作用。其有效成分包括丹参素、丹参酮、丹皮酚、芍药苷等，本课题组曾报道丹参素能提高成骨细胞的活性，防治糖皮质激素大鼠所致的骨质疏松［1］，还报道了环磷酰胺可导致大鼠和小鼠产生骨质疏松毒性［2，3］，发现环磷酰胺有抑制成骨细胞活性而导致骨丢失的作用，对骨的影响皆类似于老年型骨质疏松的病理改变。本实验观察双丹口服液对环磷酰胺介导的骨质疏松大鼠股骨的影响，并与阳性药物碳酸钙维D进行比较。现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　1.1.1 药品 丹参、牡丹皮等中药材购自本地药房，产地为四川。环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：403501。碳酸钙维D片：美国安士制药公司，批号：5B16656，每片相当于钙300mg,VitD100单位。

　　1.1.2 试剂 丹参素标准品：中国药品生物制品检定所，批号110855-200304；甲醇（色谱纯，天津四友化学试剂公司）；水为三蒸水；冰醋酸（分析纯，汕头陇西化工厂）；羟脯氨酸试剂盒（碱水解法，南京建成生物技术有限公司）。

　　1.2 仪器 AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司生产)，高效液相色谱仪：Agilent1100系列四元梯度泵、Agilent1100手动进样器, Agilent1100系列一极管阵列检测器, Agilent1100工作站( Agilent公司);超声波清洗器，858 Mini Bionix 型材料测试系统（MTS,USA）；电感偶合等离子体发射光谱仪（ICP,美国TJA公司）；UV-752紫外分光光度计（上海第三医学仪器厂）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 药物制备双丹口服液的制备工艺：参照2005年版《中国药典》的方法提取，取丹参600 g，牡丹皮300 g，牡丹皮蒸馏，收集蒸馏液。药渣和丹参加水煎煮两次，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15的清膏，加乙醇使含醇量达60%，冷藏24 h，滤过，滤液回收乙醇至相对密度1.15的清膏，加入牡丹皮蒸馏液，最后将提取液浓缩至每100 ml含生药191.7 g，密封消毒,4℃冰箱保存备用。

　　双丹口服液的质量控制：双丹口服液的指纹图谱用高效液相法检测，色谱柱：Agilient C18（250 mm×4.65 mm，5 μm）;流动相：甲醇(A)－1％冰醋酸（B）,程序梯度洗脱：10%A(5 min)-30%A(15min)；流速：1ml/min；温度为室温；检测波长：280 nm。精密称取0.104，0.208，0.312，0.520，0.624，0.728 mg的丹参素钠标准品用三蒸水定容至5 ml，分别精密吸取上述对照品20 μl注入液相色谱仪,记录色谱图,以峰面积对丹参素溶液浓度(μg/ml)进行线性回归计算,得线性回归方程：Y＝11 981X+11.492（r=0.999 9）。再根据指纹图谱中丹参素的峰面积，计算双丹口服液每毫升的丹参素含量。

　　1.3.2 动物与分组 3月龄大鼠40只，雌雄各半，体重（208±28）g，由广东医学院实验动物中心提供，SPF级，动物合格证号：2005A023。按体重对等原则随即分成4组，每组10只。正常对照组: 灌胃给予5 ml·kg-1·d-1生理盐水；环磷酰胺组: 灌胃给予环磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1；碳酸钙维D组：灌胃给予环磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1及碳酸钙维D 0.4 mg·kg-1·d-1；双丹预防组：灌胃给予环磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1及双丹口服液5 mg·kg-1·d-1。4组动物均自由饮水和进食标准饲料。实验共给药15 d，实验结束时，取右侧股骨用生理盐水纱布、锡纸包裹于-20℃保存，待骨生物力学检测及骨有机质和矿物含量检测。

　　1.3.3 骨生物力学检测［4］ 检测时，将-20℃保存的股骨常温解冻，生理盐水复湿。用858 Mini Bionix型材料测试系统监测和分析大鼠右侧股骨的生物力学性能。将股骨置于流变仪上进行三点弯曲实验，加载速度为0.01 mm/s，跨距为15 mm。记录应力-应变曲线，从曲线上读取及计算弹性强度、最大强度、断裂强度、刚性系数、弯曲能量及断裂能量吸收等指标。

　　1.3.4 骨有机质和矿物含量检测 将生物力学检测后的骨材料80℃烘干至恒重,用AE240电子天平称重;然后,每份骨样本加6 mol/L HCl在108℃温度下消化16 h后,把消化液分成两份。一份稀释后用ICP测定骨Ca，P，微量元素的含量,与骨干重进行比较,用骨矿物元素量(mg)/骨干重(g)的比值来作为骨矿物质含量的指标,骨矿物元素量/骨干重的比值越大,说明骨矿物质在骨中所占的比例越大。另一份消化液过滤后调pH值至6,然后,经《中国药典》法测定羟脯氨酸吸光度,在标准曲线中读出其含量。由于骨有机质中骨胶原占90%以上，骨胶原中羟脯氨酸含量比较稳定,约占12.5%，因此,根据骨羟脯氨酸的含量可推算出骨有机质的相对含量。即骨有机质=骨羟脯氨酸/12.5%/90%。用骨有机质/骨干重的比值作为骨有机质含量的指标。其比值越大,说明骨有机质含量越高。

　　1.3.5 数据处理 参数值用(±s)表示，用SPSS12.0进行方差分析。用变化率表示各实验组大鼠相对参数的变化〔如：变化率A=(待比较组/A组-1)×100%〕。

　　2 结果

　　2.1 双丹口服液的制备及质量控制根据1.3.1项方法制备了供实验用的双丹口服液，用高效液相色谱仪检测得到的指纹图谱见图1，丹参素标准品的图谱见图2。经检测及计算，双丹口服液每毫升含丹参素2.431 09 mg。

　　图1 双丹口服液的高效液相指纹图谱（略）

　　图2 丹参素标准品的高效液相质量控制图谱（略）

　　2.2 双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨生物力学指标的影响 结果见表1。

　　表1 双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨生物力学的影响（略）

　　n=10;A、B C为变化率:A是与对照组比较；B是与环磷酰胺模型组比较;C是与碳酸钙维D组比较；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

　　由表1可见，环磷酰胺组大鼠股骨的一系列生物力学性能均较正常大鼠呈下降趋势，其中最大强度、刚性系数的差别具有显著性，且斜型断裂面明显多于正常和药物组大鼠；提示环磷酰胺可使大鼠股骨的生物力学性能明显减弱，易产生粉碎性骨折。阳性药物碳酸钙维D组的生物力学性能指标除断裂吸收能量外，均较环磷酰胺组大鼠显著性增加，且与正常大鼠相当；提示碳酸钙维D可有效拮抗环磷酰胺造成的大鼠生物力学性能下降。双丹预防组生物力学性能指标的改变均同阳性药物一致，且数值与阳性药物相当，提示双丹口服液亦可有效拮抗环磷酰胺造成的大鼠生物力学性能下降，其作用效果与阳性药物相当。

　　2.3 双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨骨代谢生化指标的影响 结果见表2。

　　表2 双丹口服液对环磷酰胺大鼠股骨有机质和骨矿含量的影响（略）

　　n=10；A，B， C为变化率：A是与对照组比较,B是与环磷酰胺模型组比较；C是与碳酸钙维D组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

　　由表2可见，环磷酰胺使大鼠股骨骨有机质/骨干重以及钙、磷、镁三项骨矿物指数均较正常大鼠显著下降，且差别均有统计学意义（P<0.05）。提示环磷酰胺可使大鼠股骨的骨有机质和骨矿物明显丢失。碳酸钙维D组的上述4项指标均较环磷酰胺组大鼠显著上升，且骨有机质较正常大鼠仍有明显增加，提示碳酸钙维D可有效预防环磷酰胺造成的大鼠骨丢失，特别是骨胶原丢失。而双丹预防组的上述4项指标的改变与阳性药物组一致，提示双丹口服液亦可有效对抗环磷酰胺所介导的大鼠股骨骨丢失作用。

　　3 讨论

　　3.1 双丹口服液制备工艺稳定，质量可控双丹口服液的制备工艺是依据2005版《中国药典》所记载的双丹口服液的方法进行提取制备，该方法对丹参和牡丹皮分别采用针对其药材成分特点的提取步骤，有利于药材成分的有效提取。而本试验所使用的质量控制方法，其流动相采用了梯度洗脱，较药典的固定洗脱更有利于色谱峰的分离。且在标准品的制备上考虑到丹参素为水溶性成分，双丹口服液也为水相提取，因而改用三蒸水溶解。检验结果显示每毫升双丹口服液含丹参素2.431 09 mg，符合《中国药典》工艺的质量控制标准。但丹参素并不一定是双丹口服液中唯一对抗骨丢失的有效成分，故其与骨质疏松的谱效关系有待进一步地研究完善。

　　3.2 环磷酰胺可致大鼠股骨骨生物力学性能下降，双丹口服液有预防作用股骨是大鼠主要的承力组织，其骨干包围着厚而致密的骨密质，坚硬牢固，抗冲击力强。本实验采用三点弯曲法来研究股骨的材料和结构力学特性。结果显示，环磷酰胺可导致正常大鼠的一系列生物力学指标呈现下降趋势，其中表示抗骨能力的最大强度以及代表骨材料硬度的刚性系数分别下降14.8%，27.7%（P<0.05），且断裂面多为斜型。提示环磷酰胺可使大鼠股骨硬度降低，脆性增加，易产生粉碎性骨折。

　　补充钙与维生素D是各类骨质疏松的基础治疗，可有效促进骨形成和抑制骨吸收，从而提高骨骼结构性能，降低骨折风险的目的。本实验的结果也显示，碳酸钙维D除能显著对抗环磷酰胺导致的最大强度和刚性系数下降之外，还能使抗变形能力的弹性强度和弯曲能量，抗断裂能力的断裂强度以及代表骨材料可塑性的断裂应变等一系列力学指标呈现显著性上升，说明碳酸钙维D可有效对抗环磷酰胺所导致大鼠股骨的生物力学性能下降，减少骨折发生的可能，与其作为骨质疏松基础治疗药物的作用一致。

　　双丹预防组的上述性能指标改变均与阳性药物的影响一致，说明双丹口服液同碳酸钙维D一样具有对抗环磷酰胺大鼠股骨的生物力学性能下降的作用，并可有效降低骨折的发生。可能与双丹口服液基础药材的有效成分［5，6］能改善血流微循环，减轻化疗对骨髓的损伤及丹参抑制血管异位钙化,使钙沉积到骨骼［7］，从而促进骨重建和骨矿化等作用有关。

　　3.3 双丹口服液对环磷酰胺致大鼠股骨和腰椎骨矿物质丢失的拮抗作用钙、磷等无机矿物质主要通过骨矿化作用储存沉积于骨骼中，而成骨细胞分泌Ⅰ型胶原相互交联形成间隙为0.5 nm的骨基质框架是骨矿化发生的特定环境。实验结果显示，环磷酰胺组大鼠股骨和腰椎骨的钙、磷、镁均明显丢失，提示环磷酰胺可使大鼠骨骼的骨矿物质丢失。碳酸钙维D组的骨有机质和骨矿物质均较环磷酰胺组明显增加，提示碳酸钙维D可有效拮抗环磷酰胺大鼠的骨丢失作用，其可能与维生素D可增加肠道对钙、磷的吸收利用，以及促进骨胶原的形成矿化作用有关。而双丹预防组对骨有机质和矿物质的影响与阳性药物一致，说明双丹口服液也可有效拮抗环磷酰胺所引起的骨丢失作用。其可能原因：环磷酰胺所致的高浓度超氧自由基是造成骨髓损伤的主要机制之一［8］，自由基的大量沉积，势必将造成骨基质框架结构的破坏，使骨中矿物质沉积减少而导致骨钙、磷、镁的流失。双丹药材［6，9］的有效成分均具有明显清除氧自由基的作用，拮抗对成骨细胞的损伤，有效地对抗自由基大量沉积而造成的骨矿物在骨基质中的矿化沉积减少。

　　环磷酰胺致大鼠骨质疏松主要通过抑制骨形成［2］，该模型的特点是骨矿物的丢失，骨质变得薄而易碎，锥体易压缩变形，骨折风险率显著增高，对骨的病理改变类似于老年性骨质疏松的特点。碳酸钙维D因其具有增强骨形成和降低骨吸收的作用，从而被临床广泛用于治疗各型骨质疏松的基础药物。而在本实验中双丹口服液表现出与碳酸钙维D相当的对抗环磷酰胺大鼠的骨丢失及骨生物力学性能下降的作用。提示双丹口服液可能成为临床抗骨质疏松的骨形成促进剂和用于治疗老年性骨质疏松的有效药物。