免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群变化及大蒜多糖C的干预作用

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【摘要】  目的观察免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群变化并研究大蒜多糖C的干预作用。方法采用尾静脉注射卡介苗加脂多糖(BCG+LPS)建立免疫性肝损伤模型，应用流式细胞术测量小鼠外周血淋巴细胞亚群的百分比和CD4+/CD8+比值。结果模型组T淋巴细胞、CD8+ T细胞百分比值较正常对照组明显升高（P< 0.01），B淋巴细胞百分比值、CD4+/CD8+比值明显下降（P< 0.01），CD4+ T细胞百分比也有减少（P< 0.05），NK1.1+T细胞百分比无显著变化。大蒜多糖C（800 mg/kg ig，qd×12）治疗能使BCG+LPS免疫性肝损伤小鼠外周血T，B，CD4+T和CD8+T淋巴细胞百分比显著下降，而CD4+/CD8+比值显著上升，恢复到正常水平，对NK1.1+T细胞百分含量则无明显影响。结论大蒜多糖C能全面抑制免疫性肝损伤小鼠的免疫功能，并促使机体建立新的免疫平衡，从而对免疫性肝损伤产生保护作用。

【关键词】  免疫 肝损伤 淋巴细胞亚群 大蒜多糖C 流式细胞术

　　Abstract：ObjectiveTo observe the changes of lymphocyte subsets in the peripheral blood of mice with immunological liver injury and intervention of Garlic Polysaccharide C.  MethodsThe animal immunological liver damage model was reproduced by injection via the tail vein of BCG (Bacilli Calmette Guein)and lipopolysaccharide(LPS) into mice．The peripheral-blood lymphocyte subsets' percentages and the CD4+/CD8+ ratio was measured by the flow cytometry.ResultsCompared with normal control group, the percentages of the T lymphocyte and the CD8+ T lymphocyte in the peripheral-blood in immunological liver damage mice siginificantly  increased（P< 0.01）,however, the percentages of the B lymphocyte, CD4+T lymphocyte and  the ratio of CD4+/CD8+ decreased(P<0.05 or P< 0.01). Garlic polysaccharide C at dose of  800 mg/kg (ig，qd×12)  decreased the percentages of T,B,CD4+ T and CD8+ T lymphocyte in the peripheral-blood in mice treated with BCG+LPS,  however,the CD4+/CD8+ ratio increased to the normal level. The percentages of the NK1.1+T lymphocyte showed no obvious difference between control, BCG+LPS liver injury model and Garlic Polysaccharide C groups.ConclusionGarlic Polysaccharide C can inhibit the immunologic activity, and establish a new immunologic balance, thereby produce protective effects on immunological liver injury.

　　Key words：Immunity;  Liver injury；  Lymphocyte subset；  Garlic polysaccharide C；  Flow cytometry
   
　　病毒性肝炎的损害与机体的免疫应答有密切的关系［1］。卡介苗联合脂多糖(BCG+LPS)诱导的免疫性肝损伤是研究病毒性肝炎发病机制及药物防治的有效实验模型［2，3］，此模型中小鼠外周血淋巴细胞亚群的变化特征尚无定论。 大蒜药食同源，近来我们从大蒜球根中提取分离出新的安全低毒有效成分大蒜多糖C，并证实大蒜多糖C在体外有抗乙型肝炎病毒作用，对四氯化碳所致化学性及BCG+ LPS诱导的免疫性肝损伤小鼠肝功能均具保护性作用［3～5］。为此，本研究则进一步观察BCG+LPS免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群变化并研究大蒜多糖C的干预作用，以探讨大蒜多糖C护肝作用的相关免疫机制，寻求有效的抗病毒性肝炎药物。

　　1  材料和方法

　　1.1  主要药品及试剂大蒜多糖C：参照文献方法提取及纯化，纯度为92.3％［3～5］。卡介苗（BCG）活菌：兰州生物制品研究所产品，冻干粉剂，批号：20020501，使用前用灭菌生理盐水配制成1％的溶液。脂多糖（LPS）: SIGMA公司产品。小鼠单克隆抗体: FITC标记CD3试剂、PE标记CD19试剂、PE标记CD4试剂、PE标记CD8试剂以及相应同型对照，均为Caltag公司产品。流式鞘液及溶血剂（Immuno-Prep）均由Beckman Coulter公司提供。

　　1.2  动物与仪器健康雄性昆明小鼠，体重22～25g，由湖北医学科学院提供，适应1周后开始实验。主要仪器：美国Beckman Coulter公司 EPACS XL流式细胞仪。

　　1.3  动物模型、分组、标本采集及制备采用卡介苗（BCG）加脂多糖（LPS）诱发的小鼠免疫性肝损伤模型，即小鼠先尾静脉注射1% BCG活菌2 mg/只致敏，12 d后再尾静脉注射微量LPS（4μg/只）诱导肝损伤。小鼠随机分为正常对照组、免疫性肝损伤模型组、大蒜多糖C治疗组(800 mg/kg ig，qd×12)，每组20只。实验第1天，模型组及大蒜多糖C治疗组每只小鼠尾静脉注射1% BCG溶液2 mg即0.2 ml，正常对照组尾静脉注射生理盐水(0.2 ml/只)。次日起，正常组和模型组ig生理盐水qd×12；大蒜多糖C组 ig 800 mg/kg  qd×12。末次给药后，模型组、大蒜多糖C治疗组每只小鼠尾静脉注射LPS 4 μg，正常对照组给予等容积无菌生理盐水。12 h后，小鼠摘眼球取血，收集于肝素抗凝管中备测。

　　1.4  外周血淋巴细胞亚群比值测定应用流式细胞术检测。采用淋巴细胞亚群双色分析方案，按照仪器和检测试剂说明书进行。取待测肝素抗凝血样本100 μl，分别加入相应抗小鼠抗体或同型IgG对照10 μl，室温避光孵育20 min，加入溶血素溶解红细胞后，1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，用1ml 0.001M的PBS重新悬浮细胞，200目过滤网过滤样本后上机检测。

　　1.5  统计学分析实验数据以均数±标准差（ ±s）表示，两组间比较用t检验。

　　2  结果
   
　　结果见表1。与正常对照组相比，模型组T淋巴细胞、CD8+T细胞百分比值明显升高（P< 0.01），B淋巴细胞百分比值、CD4+/CD8+比值明显下降（P< 0.01），CD4+T细胞百分比值也有减少（P< 0.05），NK1.1+T细胞百分比值无显著变化。大蒜多糖C治疗组T，B，CD4+T，CD8+T淋巴细胞百分比较模型组均明显下降（P< 0.01），甚至低于正常组水平（P< 0.05或P<0.01），而CD4+/CD8+比值明显上升（P< 0.01）并与正常组无显著差异（P ＞0.05）；NK1.1+ T细胞百分比值无显著差异。　表1  大蒜多糖C对小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响（略）

　　与对照组比较，*P＜ 0.05, **P＜ 0.01；  与模型组比较，##P＜ 0.01；n=10

　　3  讨论
   
　　淋巴细胞是存在于体内的一种单核细胞，是机体免疫系统的主要构成成分之一。根据细胞功能不同，淋巴细胞主要分为T淋巴细胞（CD+3）和B淋巴细胞(CD+19)两大类，T淋巴细胞主要介导细胞免疫，B淋巴细胞主要介导体液免疫。其中T淋巴细胞又可分为CD4+、CD8+和NK1.1+ T淋巴细胞。CD4+T淋巴细胞主要由辅助性T淋巴细胞（Th）构成，其功能在于协助T、B淋巴细胞、MΦ分泌细胞因子、产生免疫应答。CD8+T淋巴细胞主要由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构成，作为效应细胞分泌细胞因子产生细胞毒性作用杀伤靶细胞。NK1.1+ T淋巴细胞是新近发现的一群细胞，现认为，NK1.1+ T淋巴细胞在防止自身免疫性疾病、控制感染及抗肿瘤免疫等方面均可发挥作用。各种T淋巴细胞之间相互影响、相互调节，保持CD4+/CD8+比值相对稳定，维持机体正常的免疫功能。淋巴细胞亚群的比例上升或下降，反映机体免疫功能发生相应变化。CD4+/CD8+比值发生变化说明机体的免疫状态失衡。
   
　　BCG联合LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤模型类似于人病毒性肝炎的急性或亚急性损伤过程，是研究病毒性肝炎较理想的模型［2，3，6］。该模型是巨噬细胞（MΦ）介导的免疫性肝损伤, 激活的MΦ能释放INF-γ，IL-1α，IL-6以及IL-8等多种细胞因子，刺激T淋巴细胞增殖、分化，并增强其功能。活化的T淋巴细胞和INF-α等细胞因子一起作用于肝细胞，发挥免疫功能产生损伤。  我们在前期研究中已经发现，大蒜多糖C对免疫性肝损伤小鼠有保护性作用，在较大剂量（800 mg/kg）时更为明显［3］，因而本部分实验也采用此剂量，进一步观察外周血淋巴细胞亚群的变化。 实验结果显示，BCG+LPS模型组小鼠CD8+ T淋巴细胞比例明显上升，这种变化导致了T淋巴细胞比例上升和B淋巴细胞比例相对性下降，CD4+/CD8+比值更是明显下降；表明该模型中小鼠免疫功能的平衡状态被打破，CTL大量增生，产生细胞毒性作用，杀伤大量正常肝细胞。在造模同时，连续给予大蒜多糖C 800 mg/kg灌胃12 d治疗后，小鼠各淋巴细胞亚群比例均下降，但CD4+/CD8+比值恢复正常；表明大蒜多糖C全面抑制BCG+LPS肝损伤小鼠机体免疫功能的过度激活，包括体液免疫和细胞免疫,阻止各种淋巴细胞增生，使其保持在较低水平，而且建立了新的免疫平衡。这种低水平的免疫平衡有两个好处: 一方面机体免疫功能受到抑制，减轻了免疫应答对正常肝细胞的损害，阻断肝损伤的进一步发展，发挥保护肝功能的作用；另一方面纠正了失衡的免疫状态，建立新的免疫平衡，有助于机体整体恢复，促进肝功能恢复。

【参考文献】
  　　［1］ 邱英锋，缪晓辉，王俊学，等.卡介苗加脂多糖建立大鼠急性免疫性肝损伤模型的研究［J］.实验动物与科学管理,2004，21(3):15.

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　　［3］ 赵 骥，郑 敏，鲍翠玉，等. 大蒜多糖C对免疫性肝损伤小鼠血清及肝组织ALT、AST的影响［J］.咸宁学院学报（医学版）,2005，19(1):24.

　　［4］ 郑 敏，卢葵花，吴基良，等.大蒜多糖体外抗乙型肝炎病毒作用研究［J］. 中药药理与临床，2005，21(3):29.

　　［5］ 郑 敏，潘世斌，姜友定，等.大蒜多糖对肝损伤小鼠血清和肝组织ALT，AST的影响及其毒性实验［J］.咸宁学院学报（医学版）, 2003，17(2)：85.

　　［6］ Ferluga J, Kaplun A, Allison AC. Protection of mice against endotoxine induced liver damage by anti-inflammatory drug［J］. Aaents Actions,1979，9(5-6):566.