枸杞RAPD反应体系的建立与优化

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        作者：严奉坤，许兴，殷敏，杨亚亚，王娜

【摘要】  目的探索枸杞RAPD反应体系并对其进行优化。方法在本实验室常用的RAPD反应体系的基础上，根据RAPD扩增效果确定枸杞基因组DNA的最佳RAPD反应体系。结果建立了适合枸杞的RAPD反应体系：20μl体系中含1× PCR buffer，50 ng模板，0.4 μM 10碱基随机引物、1UTaq DNA聚合酶、2 mM Mg2+，125μM dNTPs。 结论 枸杞的RAPD反应体系能够用于枸杞的RAPD分析。

【关键词】  枸杞； RAPD； 反应体系
　　Establishment and Optimization of RAPD Reaction System in Lycium barbarum

　　Abstract：ObjectiveTo study the RAPD reaction system in Lycium barbarum L. and optimization of it. MethodsBased on the RAPD reaction system was often used in our lab, RAPD reaction system was tested by the result of RAPD. ResultsAn RAPD reaction system suitable for Lycium barbarum L. was established, that was, 20μl amplification containing 1× PCR buffer,50ng template DNA,0.4μm primer,1UTaq DNA polymerase,2 mmol/L Mg2+, 125 μmol/L dNTPs. ConclusionThe RAPD reaction system can be used to RAPD analysis in Lycium barbarum .

　　Key words： Lycium barbarum；  RAPD；  Reaction system
   
　　RAPD由Williams和Welsh两个研究小组几乎同时于1990年建立起来的一项分子标记技术［1，2］，是目前中药研究者最常使用的DNA标记技术，但RAPD易受各种因素的干扰，其最佳扩增条件在不同物种各有不同，因此在对枸杞进行RAPD分析时，完全有必要对各因子的反应条件进行优化，建立稳定的、最佳的反应体系。本研究力图通过实验建立一种适合枸杞的RAPD反应体系。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料实验所用的材料为枸杞道地品种宁夏枸杞的主栽品种宁杞1号，采自宁夏农业生物技术重点实验室试验地。

　　1.2  仪器与试剂PCR仪（PTC-200TM Peltier Thermal Cycler，M J Research，Inc，USA）；电泳仪（DYY-10C型；北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCp-31型；北京六一仪器厂）；SmartSpecTM 3000核酸蛋白测定仪（BIO-RAD Lab，Inc，USA）；Eppendorf 5415D离心机；UVP GDS-8000凝胶成像系统。
   
　　Buffer、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、300bp DNA ladder购自北京天为时代公司， 10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司，Agarose（Promega公司），EB（瑞士Fluka Chemika公司）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  枸杞基因组DNA提取枸杞基因组DNA提取根据严奉坤等［3］的提取法进行。

　　1.3.2  PCR扩增及电泳检测反应在PTC-200型PCR仪上进行。初始扩增条件采用本实验室长期使用的20 μl反应体系，其成分为：10×Buffer（不含Mg2+）加0.8 μl 25 mmol/L Mg2+，1 μl 2.5 mmol/L dNTPs，1 UTaq DNA聚合酶，1 μl  0.375 μmol/L 10碱基随机引物，50 ng模板。反应程序：预变性94℃ 2 min；预扩增程序：94℃ 20 s，36℃ 30 s，72℃ 1 min，5个循环；扩增程序：94℃ 20 s，40℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环；然后72℃延伸10 min，最后4℃保存。扩增产物经含有0.5 μg/ml EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（72v电压下电泳45 min），电泳结束后在UVP GDS-8000凝胶成像系统上观察照相。

　　2  结果
   
　　RAPD标记对PCR反应条件有较高的要求，因此在实验前需要建立严格稳定的反应体系，以确保准确、稳定地扩增。将模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2＋浓度、dNTPs浓度、退火温度和循环次数按单因素试验方案进行扩增实验，得到优化体系的结果。

　　2.1  DNA浓度在PCR反应体系体积为20 μl，引物浓度0.375 μmol/L、 Taq DNA聚合酶1 U、Mg2＋浓度1.0 mmol/L、dNTPs浓度125 μmol/L条件下，设定模板梯度0.5，1，2，20，200，500，1 000和2 000 ng/20 μl，以确定适宜的模板浓度。结果见图1所示。从图1看出：每反应中模板的终浓度小于1 ng/μl时无扩增；在模板终浓度为1～10 ng/μl的范围内有最佳的扩增, RAPD带的式样完全重复；而超出此浓度范围如在25 ng/μl时扩增式样改变并丢失大部分带，在50 ng/μl和100 ng/μl时扩增产物一片弥散。

　　2.2  引物浓度在PCR反应体系体积为20 μl，模板浓度50 ng/20 μl、Taq DNA聚合酶1 U、Mg2＋浓度1.0 mmol/L、dNTPs 浓度125 μmol/L条件下，设定随机引物浓度0.1，0.2，0.4和0.5 μmol/L，以确定适宜的引物浓度。 结果见图2所示。从图2看出：引物浓度0.4 μmol/L时，扩增出的带型清晰、完整且背景较浅。相比之下，过高和过低都不能真实地反映扩增结果，引物浓度过高（如0.5 μmol/L）使得扩增的条带数减少，亮度下降，引物浓度过稀（如0.1 μmol/L）会使亮度下降。

　　2.3   Taq DNA聚合酶用量在PCR反应体系体积为20  μl、模板浓度50 ng/20 μl、引物浓度0.4 μmol/L、Mg2＋浓度1.0 mmol/L、dNTPs 浓度125μmol/L条件下，设定Taq DNA聚合酶0. 5，1，1. 5和2 U，以确定适宜的Taq DNA聚合酶用量，其结果图3所示。从图3看出，酶用量过低不能得到扩增产物（如0. 5U），1～2 U的酶用量不会明显地影响扩增结果。　　2.4   Mg2＋浓度在PCR反应体系体积为20 μl、模板浓度50 ng/20 μl、引物浓度0.4 μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、dNTPs 浓度125μmol/L条件下，设定Mg2＋浓度1，1.5，2.0和2.5 mmol/L，以确定适宜的Mg2＋浓度，其结果图4所示。从图4看出，随着Mg2＋浓度的提高主带亮度逐渐增强，扩增带条数减少，弱带消失,在2 mmol/L时带型稳定且亮度适宜。

　　图1  模板DNA浓度对枸杞RAPD扩增的影响(ng/20μl)（略）

　　图2  引物浓度梯度实验（略）   

　　图3  Taq DNA聚合酶用量梯度实验（略）

　　图4  Mg2＋浓度梯度实验（略）      

　　图5  dNTPs浓度梯度实验 （略）

　　图6  退火温度梯度实验(℃) （略）     

　　图7  循环次数梯度实验 （略）     

　　2.5  dNTPs浓度在PCR反应体系体积为20 μl、模板浓度50 ng/20 μl、引物浓度0.4 μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U，Mg2＋浓度2.0 mmol/L条件下，设定dNTPs浓度50，100，150和200 μmol/L，以确定适宜的dNTPs浓度。结果见图5所示。从图5看出，随着dNTPs浓度的提高主带亮度逐渐增强，在150 μmol/L时带型稳定且亮度适宜。

　　2.6  退火温度在PCR反应体系体积为20 μl、模板浓度50 ng/20 μl、引物浓度0.4 μmol/L，Taq DNA聚合酶1U，Mg2＋浓度2 mmol/L、dNTPs浓度150 μmol/L条件下，设定退火温度梯度34，36，38和40℃，以确定适宜的退火温度。结果见图6所示。从图6看出：退火温度过低（34℃）会有非特异性扩增条带出现，36～40℃能得到稳定的结果。

　　2.7  循环次数在PCR反应体系体积为20 μl，模板浓度50 ng/20 μl，引物浓度0.4 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，Mg2＋浓度2 mmol/L，dNTPs浓度150 μmol/L条件下，设定循环次数梯度35，40，43和46，以确定适宜的循环次数。结果见图7所示。从图7看出，随着循环次数的增加扩增量显著提高，循环40次带型稳定且亮度适宜。
   
　　综上，最终确定整个反应体系各种试剂的浓度：模板20～200 ng、随机引物浓度0.1～0.4 μmol/L，Taq DNA聚合酶1～2 U，Mg2＋浓度1.5～2.5 mmol/L，dNTPs浓度100～200 μmol/L。根据实验结果，整个反应体系各试剂的用量如表1所示。

　　表1  PCR反应体系各试剂用量（略）

　　反应程序为：预变性94℃ 2 min；预扩增程序：94℃ 20 s，36℃ 30 s，72℃ 1 min，5个循环；扩增程序：94℃ 20 s，40℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环；然后72℃延伸10 min，最后4℃保存。

　　2.8  优化的PCR反应体系扩增结果的稳定性为了验证优化的PCR反应体系扩增结果的稳定性，随机挑选了筛选出的15条随机引物（编号及序列见表2）运用表1所示的反应体系进行了扩增，其结果如图8所示：所有引物都能得到好的扩增结果, 说明优化的反应体系的扩增是稳定的，只要反应条件一致，RAPD标记方法是完全能够经得起重复的。

　　表2  随机引物序列及编号（略）

　　图8  15条引物扩增宁杞1号的RAPD图谱（略）

　　3  讨论

　　3.1   PCR反应体系的各种成分是一个有机的整体，对于RAPD而言，在进行一个新类群的RAPD-PCR时应事先确定该类群的最适DNA模板浓度范围；由于RAPD-PCR中模板与引物浓度的比例影响扩增产物的质与量，直接关系到可重复性，这种情况与常规PCR不一样，在特异性扩增中，增加模板或引物浓度时，可期望得到更多的产量但并不扩增新的更多的位点，所以确定了最适DNA模板浓度范围后，紧接着要对引物浓度进行优化；不同厂家、不同商家的DNA聚合酶常常给出不同的RAPD产物，因此开始选择什么样的DNA聚合酶很重要，若中途更换酶，不可能重复原来的实验结果，在RAPD-PCR中酶的用量大都为每反应0.5～1 U（25 μl），这与聚合酶的来源有关，有时可达 2.5 U，用量过多会产生非特异性扩增，随着酶用量的增加甘油含量随之增加，会抑制PCR反应；dNTPs（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）是PCR的原料，常用50～200 μmol/L，浓度太高产生错误掺入，浓度太低产率太低，在RAPD中多用100～200 μmol/L；最佳扩增程序提供PCR最佳扩增结果，扩增程序中PCR对退火温度最敏感，RAPD-PCR的退火温度一般都在40℃以下，36～40℃比较适宜，小于36℃会得到非特异性扩增条带；循环次数依PCR热循环仪的型号有较大的变化，循环次数太少扩增量不足，循环次数增加扩增量显著提高但同时非特异性扩增的机会增加。

　　3.2  由于RAPD-PCR对反应条件过于敏感，在对一个新类群进行RAPD分析时，完全有必要对各因子的反应条件进行优化，建立稳定的、最佳的反应体系；建立了最佳的反应体系后，要加强RAPD反应程序的标准化［4］，以保证实验条件的一致性来增强RAPD的可重复性。

【参考文献】
  　　［1］ Williams J G, Kubelik A R, Livak K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic makers ［J］.Nucleic Acids Res,1990,25(18):6531.

　　［2］ Welsh J, Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Res,1990,25(18):7213.

　　［3］ 严奉坤,许 兴,魏玉清,等.枸杞基因组DNA提取及指纹图谱分析［J］.时珍国医国药, 2007,18 (1) : 46.

　　［4］ 郭宝林,戴 波.中药材DNA分子标记研究的技术问题.Ⅱ. RAPD实验技术和方法学论述［J］.中草药,2002,33(2):178.