反相高效液相色谱法测定清益康乳膏中苦参碱的含量

amy54321 · 发表于 2014-8-17 22:39:39

      作者：唐坤，李标，夏晨燕，江怀仲，向浏欣

【摘要】  目的通过反相高效液相色谱法建立清益乳膏中苦参碱的含量测定方法。方法依利特SinoChrom ODSBP柱（416 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈0.02 mol/L KH2PO4溶液0.02 mol/L十二烷基硫酸钠（20∶40∶40），流速：1.0 ml/min，检测波长为210 nm。结果苦参碱在40.00～200.0 μg·ml-1 呈现良好的线性关系（r=0.999 8），在清益康乳膏中的平均回收率为98.44%，RSD为1.97%（n=6）。结论该法灵敏、准确、专属性强、重现性好，可作为清益康乳膏的质量控制方法。

【关键词】  清益康乳膏；苦参碱；反相高效液相色谱；含量测定

　　Abstract：ObjectiveTo establish an assay of matrine in Qingyikang Creams by RP-HPLC.MethodsSinoChrom ODS-BP (416 mm×250 mm,5 μm) analytical column was used. The mobile phase consisted of Acetonitrile0.02 mol/L KH2PO4-0.02 mol/L Sodium DodeeyL Sulfate9(20∶40∶40).The detection wavelength was 210 nm.ResultsThe calibration curves were linear between 40.00～200.00 mg·L-1(r=0.999 8).The average recoveries of matrine in Qingyikang Creams were 98.44%.RSD were 1.97%(n=6).ConclusionThe method is simple ,rapid ,accurate and is suitable for the determination of Qingykang Creams.

　　Key words：Qingyikang Creams;  Matrine;  RPHPLC;  Determination

　　清益康乳膏由蜂胶、苦参等4味中药制成，具有清利湿热、止痛解毒的功效，外用主要治疗带状疱疹等皮肤科疾病。该方原为酊剂，但由于使用不方便，且对皮肤有一定的刺激性，后改制成o/w型的乳膏。文中主要将乳膏中的主要活性成分苦参碱（matrine）［1］作为主要的含测指标。因此本实验采用反相高效液相（RPHPLC）法来测定制剂中苦参碱的含量，结果显示本实验方法系统适应性强，能准确、快速，有效的控制产品质量。现报道如下。

　　1  器材

　　1.1  仪器日本岛津LC10AT高效液相色谱仪，SPD-10A检测器，A4800色谱工作站，7725i手动进样阀（20 μl）。微孔滤膜（0.45 μm，上海新亚净化器厂），PHS25型精密pH计（上海日岛科学仪器有限公司），HS3120型声波清洗器（天津phenomen公司），Elix/纯水系统（美MILLIPORE）。

　　1.2  试剂乙腈为进口色谱纯；苦参碱标准品（中国药品生物制品检定所110805-200306，含量测定用）；中性氧化铝（100～200目，层析，上海陆都化学试剂厂）；水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯规格。药材除蜂胶propolis购自云南昆明嵩明养蜂厂外，其余均购自重庆市药材公司。乳膏样品与阴性样品均为自制。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件与系统适用性试验色谱柱：依利特SinoChrom ODSBP柱（416 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈0.02 mol/L KH2PO4溶液-0.02 mol/L十二烷基硫酸钠（20∶40∶40）［2］，流速：1.0 ml/min，检测波长为210 nm，理论塔板数按苦参碱（C15H24N2O）峰计算，应不低于3 000；柱温为30℃。流动相临用前以微孔滤膜过滤并经超声脱气处理。

　　其分离色谱见图1。在此条件下，供试品中苦参峰与其他峰能达到基线分离，苦参碱色谱峰的保留时间约为10 min。

　　a对照品  b清益康乳膏  c阴性对照  1.苦参碱

　　图1  色谱图（略）

　　2.2  对照品溶液的制备取110℃干燥至恒重的苦参碱对照品，精密称取苦参碱5 mg，置5 ml量瓶中，加无水乙醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升中约含苦参碱200 μg）。

　　2.3  供试品溶液的制备取清益康乳膏1.0 g，精密称定，加甲醇20 ml，加热回流15 min至冷，滤过，滤液蒸干后用25 ml氯仿液分3次洗脱，收集洗脱液，加入浓氨水1.5 ml，混匀，密塞，稳定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量。用氯仿补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 ml，通过中性氧化铝柱（200～300目，内径10 mm，5 g），依次以氯仿，氯仿-甲醇（7∶3）各20 ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣用无水乙醇适量溶解，转移至10 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.4  标准曲线的制备精密称取苦参碱对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，4.4，5.0 ml置5 ml量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。取上述溶液10 μl进样，每个浓度重复进样3次，按上述色谱条件测定峰面积。3次所得平均峰面积积分值（A）与相应的苦参碱对照品进样量（X）之间的回归方程为A=129 881 0X+4 591.638，r=0.999 8。苦参碱进样量在40～200 μg·ml-1范围内与峰面积分值成线性关系。

　　2.5  精密度实验精密吸取苦参碱对照品溶液，重复进样6次，测定苦参碱峰面积，其RSD为0.72%。　　2.6  重现性实验取同一批号样品，分别称取5份，按上述供试品溶液的制备及色谱条件，依法测定苦参碱的含量。结果见表1。

　　表1  重现性实验结果（略）

　　2.7  加样回收率采用加样回收法。精密取苦参碱对照品各适量，分别加入已知苦参碱含量（1.0 mg/g）的样品中，按上述“2.3”项下制成供试品溶液并测定，计算回收率。结果见表2。

　　表2  苦参碱回收率测定结果（略）

　　2.8  样品含量测定结果取5批样品，依“2.3”项制备样品溶液，每批制备2份，分别精密吸取供试品溶液15 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算5批样品的含量。结果见表3。

　　表3  样品中苦参碱的含量测定结果（略）

　　3  讨论

　　3.1  对制剂指标性成分的选择苦参、蜂胶为该制剂中的两味主药，而蜂胶的成分复杂，除含树脂50%～60%，蜂蜡30%外，还含300多种的黄酮类化全物［3］，因此样品的提纯步骤复杂，回收率较低，给定量分析造成了一定困难。故针对制剂所治病症，本实验选择了具有抗菌、抗病毒、抗过敏等［4］作用的苦参碱为制剂检测的主要指标性成分。

　　3.2  对苦参碱含量测定方法的选择目前对苦参碱（matrine）含量测定的文献报道主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、毛细管电泳法（CE）等［5，6］，其中2005版《中国药典》里对苦参的含量测定主要是以氨基键合硅胶为填充柱来分析喹喏里西啶类生物碱，此法虽然分离效果较好，但实验操作较繁琐，样品须经固相萃取净化；另外薄层扫描法是一种离线技术，其各步操作基本上是在开放体系中进行，因此，影响定量结果的因素较复杂，准确较差［7］，因此为了有效控制制剂的质量标准，结合现有的试验条件，本实验应用RP-HPLC法来测定样品中苦参碱的含量。

　　3.3  苦参碱选择波长的确定2005版《中国药典》中，HPLC法测定苦参碱和氧化苦参碱的检测波长在220 nm处［8］，但本实验取苦参碱的对照品溶液，于200～500 nm波长内扫描，结果苦参碱乙醇液在210 nm有最大吸收，流动相中无水乙醇的紫外线吸收干扰小，基线稳定，因此选择210 nm为检测波长。

　　3.4  提取方法的考察样品的预处理比较酸提碱沉和浓氨水碱化氯仿提取的方法，结果前者操作繁琐，提取效果不如后者。试验中还发现在制备供试液时，为了能使中药的有效成分与多种乳膏基质很好分离，最好采用甲醇回流使乳膏破乳，待滤液充分冷却后再过滤的方法，这样就能较好的去除乳剂基质对含测成分的干扰。

　　3.5  流动相的选择本文流动相的选择主要是在原清益康酊剂含量测定方法的基础上进一步修改完善而成，因原方法主要采用薄层-高效液相色谱［9］，经过对几个流动相分离样品效果的比较，结果还是以本实验的流动相取得的效果较满意，因为乙腈的紫外末端吸收较小，而苦参碱也为紫外末端吸收，故采用乙腈作为流动相的系统组成；而与纯水流动相相比，采用磷酸盐-SDS离子对的流动相，不仅可以使样品在非极性固定相中的溶解度增大，分配系数增加，有效避免其他生物碱成分的干扰，而且能使分离成分的色谱峰形状发生变化，保留时间延长。

【参考文献】
  　　［1］吴立军.中药化学［M］.北京：中国医药科技出版社，2000：53.

　　［2］马开宇，刘丛彬.RP-HPLC法测定妇炎康片中苦参碱的含量［J］.安徽医药，2005，9（9）：669.

　　［3］ Khalil ML.Biological activity of beepropolis in health and disease［J］.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention.2006，7（1）：22.

　　［4］樊宏伟，卢继红，张蓉.苦参碱类生物碱的体外抑菌、抑病毒及诱生干扰素的实验研究［J］.中医药信息，2000，4：75.

　　［5］ Chen C,Yi C,Yang X.Liquid chromatography of active priciples in Sophora flavescens root［J］.Journal Of Chromatography.B,Analytical Technologies in The Biomedical And Life Sciences,2004,812(1～2)：149.

　　［6］ Wu Y,Shao Q.Zhen Z.Determination of quinolizidine alkaloids in Sophora flavescens and is ts preparation using capillary electrophoresis ［J］.Biomedical Chromatongraphy,2006,20(5)：446.

　　［7］ Zhang Lei,Chen Xiao-hui,Li Juan.Determination of the content of matrine in Sophora flavescens Ait ［J］.Jorunal of shenyanag Pharmaceutical University.2005,22(1)：33.

　　［8］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：140.

　　［9］唐坤，王伯初，李标.清益康酊剂提取工艺研究［J］.中成药，2006，28（4）：582.

		自动登录	找回密码
密码			立即注册

[药学] 反相高效液相色谱法测定清益康乳膏中苦参碱的含量