丹参酚酸B的荧光特性研究

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【摘要】  目的研究丹酚酸B的荧光性质。方法采用大孔树脂吸附和醋酸乙酯萃取，自丹参药材中分离丹酚酸B，采用荧光扫描确定其激发波长和发射波长，考察pH、温度及光照时间对其荧光强度的影响。结果丹酚酸B的激发波长和发射波长分别为394 nm和501 nm。pH酸性、提高温度和延长光照时间可提高丹酚酸B的荧光强度。结论丹酚酸B在酸性条件下稳定，温度和光照可加强其荧光效应。

【关键词】  丹酚酸B； 荧光光谱； 稳定性

　　Fluorescence Properties of Salvianolic Acid B in Root of Salvia miltiorrhiza Bge.

　　　Abstract：ObjectiveTo research the fluorescence properties of salvianolic acid B. MethodsTo separate salvianolic acid B from the root of Salvia miltiorrhiza Bge.by macro-reticular resin adsorption and acetyl ester extraction, scan its excitation and emission wavelength by fluorescence spectrophotometer, inspect the effect of pH, temperature and illumination time on its fluorescence intensity. ResultsIts excitation and emission wavelength were respectively 394 nm and 501 nm. Acid, heating and illumination promoted its fluorescence intensity. ConclusionSalvianolic acid B was stable in acid condition, heating and illumination were helpful to its fluorescence effect.

　　Key words：Salvianolic acid B;  Fluorescence spectrum;  Stability
   
　　光动力疗法（Photodynamic Diagnosis & Therapy）是肿瘤诊断和治疗的有效新方法，其中光敏剂的选择是关键。目前临床常用的光敏剂为多种卟啉类衍生物混合物，给药后需避光1～2个月，给患者带来较大不便［1］。故从天然产物中寻找毒副作用小的新型光敏剂已成为研究的热点。中药含有多种活性化合物，已有文献报道补骨脂素、姜黄素、大黄素等具有光敏活性［2］。中药丹参Salvia miltiorrhiza Bge.中有效成分有丹参酮和丹酚酸，前者的荧光性质已有报道［3］。由于丹酚酸（Salvianolic acids）是水溶性有效成分，以丹酚酸B含量最高［4］。丹酚酸B是由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成，其结构如图1所示。分子结构中存在较多共轭环，势必对其光学活性产生一定影响。有关此方面的研究尚无文献报道。为了探索丹酚酸B的光敏活性，本实验对其荧光性质进行了研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料与试药丹参药材（湖北产，60℃减压干燥后，粉碎过40目筛），HPD100（河北沧州宝恩化工有限公司）。

　　1.2  仪器 F-4500荧光光谱仪（日立公司），RE52CS-1旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  丹酚酸B的分离纯化 药材粉100 g，加50%乙醇800 ml 60℃提取2 h，过滤，滤液减压浓缩至200 ml，用20%盐酸调pH至3，离心（3 000 r/min，10 min）去沉淀。加入HPD100大孔树脂30 g（预先用95%乙醇浸泡24 h，再用水洗净），放置8 h，用50 ml水洗3次，再用70%乙醇100 ml分2次淋洗，收集乙醇液，减压回收至干，加入醋酸乙酯50 ml提取，提取液回收溶剂至干，得固体物2.3 g。经薄层鉴别，呈现一个丹酚酸B斑点。

　　图1  丹酚酸B分子结构（略）

　　1.3.2  荧光光谱测定称取分离的丹酚酸B样品0.2 g，加50 ml甲醇溶解，以此供试液进行荧光扫描测定。

　　2  结果

　　2.1  丹酚酸B的激发光谱和发射光谱 以200～700 nm扫描丹酚酸B的激发波长，发现394 nm为其最大激发波长。以该波长激发，获得其最大发射波长为501 nm。如图2所示，丹酚酸B的激发波谱范围较窄，在380～430 nm之间，但其发射波谱范围较宽，在400～600 nm之间，这归因于分子结构中分散的共轭体系。由于630 nm以上的光才具有较强的生物组织穿透力，丹酚酸B的激发波长穿透能力较弱，只适于浅表肿瘤或血管内照射进行的光动力治疗。其发射波谱宽，对肿瘤的选择性较差，但适用范围广，因而也是一种具有潜在价值的光敏活性物质。　　2.2   pH对丹酚酸B荧光强度的影响 滴加10%盐酸和10%氢氧化钠调节供试液的pH，结果表明，在酸性环境中，丹酚酸B的发射强度增加，最大发射光谱未发生改变，但在碱性条件下，发射强度降低，最大发射波长蓝移，为497 nm，并在397 nm处出现另一发射峰。这表明丹酚酸B在酸性条件下稳定，但在碱性条件下发生了结构破坏，可能引起解离，故产生了另一个发射峰，并导致原来发射荧光强度的降低。见图3。

　　图2  丹酚酸B的激发光谱（左）和发射光谱（右）（略）

　　2.3  光照对丹酚酸B荧光强度的影响将供试液置入密封可透光的玻璃容器中，放在自然光下（100 00 lux），每隔一定时间测定其发射光谱。结果表明，丹酚酸B的最大发射波长在光照下未发生移动，荧光强度随照射时间增加而增加。这说明光照对丹酚酸B具有活化作用。见图4。

　　2.4  温度对丹酚酸B荧光强度的影响将供试液置入恒温水浴中保温，设定温度20, 30, 40, 50, 60℃，每温度保温30 min，测定其荧光强度。结果表明随温度提高，丹酚酸B的荧光强度随温度提高有所增加，但增加的幅度不大，40℃后渐趋稳定。说明在60℃温度范围内，丹酚酸B可保持较好的稳定性。见图5。

　　图3  不同pH条件下丹酚酸B荧光光谱的变化（略）

　　图4  光照时间与丹酚酸B荧光强度的关系（略）

　　图5  温度与丹酚酸B荧光强度的关系（略）

　　3  讨论
   
　　丹酚酸B是中药丹参中的主要活性成分之一，具有抗动脉粥样硬化、保护心肌细胞、防心脑缺血损伤、抗血小板凝聚、抗肝纤维化、改善记忆、抗肿瘤等作用［5］。丹酚酸B具有荧光活性，利用此性质，可进行定性定量检测，并可提高其对肿瘤部位的靶向作用，从而提高其作用效果。
   
　　本实验考察了pH、温度、光照对丹酚酸B荧光强度的影响。由于实验是在有机溶剂中密闭条件下进行，故可避免条件改变导致氧化对丹酚酸B结构的破坏。实验结果表明，pH酸性、一定温度和光照有利于丹酚酸B荧光强度的增加，不会导致其结构的破坏。至于丹酚酸B对肿瘤细胞的光敏杀伤作用有待进一步探讨。

【参考文献】
  　　［1］ 王瑞平,李迎新.光动力疗法在肿瘤治疗中的应用［J］.国外医学·生物医学工程分册,1999,22(6):355.

　　［2］ 许川山, Albert Wing Lang Leung. 中药光敏剂介导的光动力疗法［J］.激光杂志, 2004, 25(6): 92.

　　［3］ 李俊芬, 董 川, 杨 频. 两种丹参酮化合物分子的荧光特性及分析方法研究［J］.光谱实验室, 2003, 20(6): 821.

　　［4］ 李 静, 何丽一, 宋万志. 丹参中水溶性酚酸类成分的薄层扫描测定法［J］.药学学报, 1993,28(7): 543.

　　［5］ 李认书, 李永强. 丹酚酸研究进展［J］. 时珍国医国药, 2003, 14(6): 371.