参芪复方对GK大鼠2型糖尿病大血管病变CD36 mRNA及ox-LDL的影响

amy54321 · 发表于 2014-8-17 22:37:22

      作者：谢毅强，谢春光，张红敏

【摘要】  目的观察参芪复方对GK大鼠2型糖尿病大血管病变胸主动脉CD36 mRNA表达及血清ox-LDL的影响。方法SPF级GK大鼠（自发性糖尿病大鼠）44只及Wistar大鼠11只按血糖水平随机分为正常对照组、模型组、雷米普利组、参芪复方低剂量组、参芪复方高剂量组。4组GK大鼠组造模：10 mg·kg-1·d-1腹腔注射N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME），同时给高脂饮食，连续14 d造模。正常对照组给生理盐水。2周后开始给药，各组分别给相应受试药物28天。用ELISA法测ox-LDL，用实时定量PCR法测胸主动脉CD-36 mRNA表达。结果参芪复方高、低剂量组的血清ox-LDL含量较模型组明显降低(P<0.05),胸主动脉CD36 mRNA的表达显著低于模型组组（P<0.01），血清ox-LDL含量与胸主动脉CD36 mRNA的Ct值进行相关性分析，相关系数r=-0.60, P<0.01。结论以益气养阴、清热生津、活血化瘀为治则的参芪复方能明显下调GK大鼠内皮细胞损伤的CD36 mRNA的表达，抑制CD36的生成，可以阻断CD36对ox-LDL的摄取，可能是参芪复方治疗T2DM大血管病变的机制之一。

【关键词】  2型糖尿病大血管病变； GK大鼠；参芪复方

　　Abstract：ObjectiveTo explore the effects of Shenqi compound recipe treating type Ⅱ diabetes mellitus (T2DM) on macrovascular complications in GK rats and correlation with thoracic aorta CD36 mRNA and serum Oxidated low density lipoprotein (ox-LDL). MethodsGK rats were randomly divided into Model group, Ramipril group, Shenqi compound Recipe low dosage group,  Shenqi compound recipe high dosage group and wistar control group. Each group was administrated correspondent substance respectively for 28 days after intra-peritonelly L-NAME 2 weeks except wistar control group. Determined ox-LDL in serum by ELISA. The mRNA expression of CD36 in aorta by real time RT-PCR. Compared the correlation with ox-LDL and CD36 mRNA. ResultsContent of ox-LDL decreased in Shenqi compound recipe low dosage and high dosage group compared with model group (P<0.05). The expression of thoracic aorta CD36 mRNA in Shenqi compound recipe low dosage and high dosage group also decreased remarkably compared with model group (P<0.01). Ox-LDL and CD36 mRNA's Ct had correlated negatively with lined（r=-0.60,P<0.01）.ConclusionShenqi compound recipe with principle tonifying "Qi" and "Yin" and  promoting blood circulation to dispate stasis can decreased the production of CD36, inhibited the expression of thoracic aorta CD36 mRNA in GK rats. May be it was one of the mechanism of Shenqi compound recipe  treating T2DM on macrovascular complications.

　　Key words：Type Ⅱ Diabetes Mellitus Macrovascular Complications;  GK rats;  Shengi Compound Recipe

　　糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一种严重影响人类生命健康的疾病，已成为发达国家的第三大非传染病。它是以胰岛分泌、作用或二者均有缺陷所致的以高血糖为特征的一组代谢性疾病。全球目前有超过1.5亿的患者，我国现在已有4 000万左右的患者。到2010年，这一数字将达到6 300万。在DM中，2型糖尿病（Type Ⅱ diabetes mellitus, T2DM）是发病的主体，约占90%。糖尿病慢性并发症，特别是血管并发症目前仍然是治疗上的难题，也是糖尿病患者死亡和致残的主要原因。本实验通过观察益气养阴、活血化淤的参芪复方对2型糖尿病GK大鼠（自发性糖尿病大鼠）胸主动脉清道夫受体CD36 mRNA及血清氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的影响，从血管内皮损伤的角度来阐述参芪复方治疗2型糖尿病大血管并发症的机理。

　　1  材料

　　1.1  药品与试剂 N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitio-L-arginine methyl ester, L-NAME）：sigma公司产品，批号SL04176；大鼠ox-LDL试剂盒，批号20041211；实时定量聚合酶链反应（real time PCR）试剂盒，SYBRPremix Ex TaqTM，批号BK401；反转录第1条互补脱氧核糖核酸（cDNA）链合成试剂盒，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit,批号1140；PCR引物：PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)纯度级；参芪复方浸膏粉：1g浸膏相当于原生药10g，由四川大学华西药学院制药厂生产，批号031008；雷米普利片：5 mg/片，Aventis Pharma S.P.A（意大利）生产，批号L420；icycler IQTM荧光实时多波长PCR检测系统；BioRad型酶标仪。

　　1.2  动物模型的建立和分组Wistar大鼠11只，雄性，4月龄，体重385～420 g。由四川大学华西医学中心实验动物中心提供，SPF级，合格证号为川实动管第9号。GK(Goto－Kakisaki Wistar rats)大鼠50只，4月龄，雄性，体重326～408 g。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，SPF级。合格证号为0005219，许可证号为SCXK(沪)2003-0003。50只GK大鼠适应性饲养一周后，测随机血糖11.1 mmol·L-1以上者44只入选，根据随机数字表将其分为模型组、雷米普利组、参芪复方低剂量组、参芪复方高剂量组各11只， Wistar大鼠11只作为正常对照组，共5组。其中模型组、雷米普利组、参芪复方低剂量组、参芪复方高剂量组参照文献方法［1～3］造模：10 mg·kg-1·d-1腹腔注射一氧化氮合酶（NOS）抑制剂-L-NAME，同时给高脂饮食，连续14 d，诱导早期动脉粥样硬化。

　　1.3  给药及方法造模2周后开始给药，给药1次/d，连续给药28 d，每天10点左右给药，灌胃同时除空白组给普通饲料外，其余均继续给高脂饮食，各组给药名称及剂量见表1。

　　表1  各组给药名称及剂量（略）

　　动物给药28 d后处死，按2 ml·kg-1体重腹腔注射8%异戊巴比妥钠麻醉后取腹主动脉血约10～15 ml，分离血清，-20℃保存；解剖取胸主动脉，冰上除去胸主动脉周围组织及动脉腔内积血，将部分胸主动脉放入液氮中，备检信使核糖核酸（mRNA）。

　　1.4  指标测定

　　1.4.1  胸主动脉CD36 mRNA的表达（Real Time PCR法）CD36的引物序列F：5′-ACACCCGAATCCTCACTGGAA-3′;R：5′-GGACCCGTTGGCA AACAAAG-3′（GeneBank(NM_031541)，扩增长度：138 bp。管家基因β-actin的引物序列为： F：5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′;R：5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′（GeneBank(NM_031144)，扩增长度：104 bp。以管家基因β-actin作为参照标准来比较各目的基因表达量的差异，即用目的基因的Ct值与β-actin的Ct值之比来表示，比值越大说明目的基因mRNA的量越少。实时定量PCR扩增产物的鉴定采用融解曲线分析法和琼脂糖凝胶电泳法。

　　1.4.2  血清ox-LDL的测定采用酶联免疫吸附法（ELISA），按照试剂盒说明书进行。

　　1.5  统计学处理计量资料均以±s表示，多样本均数的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），采用SPSS12.0统计软件进行分析。变量的关联性采用线性相关(Regression linear)分析。　　2  结果

　　2.1  GK大鼠胸主动脉CD36 mRNA的Ct值及血清ox-LDL的含量见表2及图1～2。

　　表2  GK大鼠胸主动脉CD36 mRNA的Ct值及血清ox-LDL的含量（略）

　　与正常对照组比较，△P<0.01，△△P>0.05；与模型组比较，*P<0.01,**P>0.05,☆P<0.05；与雷米普利组比较，#P>0.05,##P<0.01；n=11

　　从表2可以看出，模型组、雷米普利组及参芪复方低剂量组、参芪复方高剂量组的ox-LDL血清含量均较空白组明显升高(P<0.01)。与模型组比较，参芪复方高剂量组的ox-LDL血清含量明显下降(P<0.01)，参芪复方低剂量组有所下降(P<0.05)，而雷米普利组无明显变化(P>0.05)。与雷米普利组比较，参芪复方低剂量组有所下降(P<0.05)，参芪复方高剂量组有显著下降(P<0.01)。模型组CD36 mRNA的表达显著高于正常对照组（P<0.01），而治疗各组与正常对照组无明显差异（P>0.05）。治疗各组与模型组比较CD36 mRNA的表达均明显降低（P<0.01）。治疗各组比较，无明显差异（P>0.05）。

　　图1  胸主动脉CD36 mRNA融解曲线（略）

　　图2  胸主动脉血管CD36 mRNA电泳图（略）

　　2.2  血清ox-LDL与胸主动脉CD36 mRNA表达的相关性分析将所有大鼠的血清ox-LDL含量与胸主动脉CD36 mRNA的Ct值进行相关性分析，得到Y=578.76-103.70X的直线方程，相关系数r=-0.60,P<0.01，二者呈负相关。见图3。

　　图3  血清ox-LDL与胸主动脉CD36 mRNA表达的相关性分析（略）

　　3  讨论

　　ox-LDL是LDL经氧化修饰后形成的，它有吸引及滞留单核细胞的作用，由于ox-LDL失去了原有的受体结构类型，不能被血液中的单核细胞及巨噬细胞所识别，因而巨噬细胞将ox-LDL视为异己而无反馈地大量吞噬，最后破裂释放出毒性物质，进一步损害血管内皮细胞，大量ox-LDL沉积于受损的血管内皮下而形成动脉粥样硬化斑块或加重动脉粥样硬化（AS）的形成。有研究显示，无论有无血管病变，糖尿病患者的血浆ox－LDL的水平均明显升高［4］，提示糖尿病患者体内的抗氧化防御功能和过氧化反应处于失衡状态，检测ox－LDL浓度可间接反映患者动脉硬化程度。ox -LDL还可直接与血管基质结合,使基底膜增厚及血管壁弹性降低，直接损伤血管内皮细胞，增加凝血酶原的活性，刺激血小板的聚集。CD36属于B类清道夫受体，它是一种细胞表面单糖蛋白，广泛存在于单核细胞、血小板、内皮细胞、视网膜色素上皮细胞和脂肪细胞［5］。在AS病变中可以发现CD36的表达［6］。CD36可以和经化学修饰的脂蛋白结合，在AS的过程中具有重要意义［7］。有证据表明，在CD36基因缺陷的人中，单核细胞源性巨噬细胞对ox-LDL的摄取率下降40%［5］，提示CD36对ox-LDL的摄取在动脉粥样硬化中有重要作用。最近研究也表明，脂蛋白脂质可以上调CD36基因和蛋白的表达，改变细胞胆固醇水平可以使CD36的表达水平及结合ox-LDL的能力改变［8］。这些都提示，CD36与脂质代谢及代谢紊乱有密切关系。

　　中医认为，痰浊淤血互结贯穿于DM大血管病变的始末，它是造成DM大血管病变的主要原因。随着痰浊淤血互结的加重， DM大血管病变病情也随之加重。血流缓慢，痰浊淤血滞留在脉络腔和互结于脉络壁，管壁增厚，管腔狭窄，血管闭阻。血管病变与痰浊淤血互结的分布，均按阴虚火旺，气阴两虚，阴阳两虚而递增，病情也随之发展加重，表明两者有共同分布规律和发展趋向。脾虚气弱，阴津下流，上不奉心肺而燥热，下不滋肝肾而阴亏的症状和DM大血管病变中存在的气机失调，湿邪痰浊蕴滞，血液黏稠度增高、甚或血淤，毒邪蓄积等特有的病理态势，将其病机归纳为虚、痰、淤、毒四端，颇能反映出该病本虚标实的病理特点。消渴病的发生发展过程中气阴两虚是主要的病机，而淤血是贯穿于始终的重要因素。以此为出发点，创制的参芪复方以益气养阴、清热生津、活血化淤为治疗大法，由人参、黄芪、山药、山茱萸、生地、天花粉、丹参、制大黄等组成，以补本虚为主，泻标实为辅，与糖尿病及其大血管病变的病机十分吻合。

　　本研究表明参芪复方能明显下调GK大鼠内皮细胞损伤的CD36 mRNA的表达，抑制CD36的生成，可以阻断CD36对ox-LDL的摄取，从而阻止了T2DM大血管病变从内皮细胞损伤到血管平滑肌细胞增殖，再到AS的发生和发展过程。相关性分析显示出胸主动脉CD36 mRNA的表达与血清ox-LDL的含量成正相关，进一步证实了CD36与ox-LDL在T2DM脂代谢紊乱中的作用以及CD36对ox-LDL的摄取在血管内皮损伤过程中的作用。提示参芪复方在T2DM大血管并发症的治疗上具有良好的应用前景。

【参考文献】
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　　［4］ Sparrow CP，Parthasarathy S，Steinberg D.A macrophage recetor that oxidized low density lipoproteinbut not acetylated low density lipoprotein［J］.J Biol Chem,1989, 264:2599.

　　［5］冯忠军，张淑兰，樊锡风，等.糖尿病患者血浆氧化修饰低密度脂蛋白的测定及临床意义［J］.河北医科大学学报,2001,22(2):93.

　　［6］ Yamada Y, Doi T, Hamakubo T, et al. Scavenger receptor family proteins: roles for ath- erosclerosis, host defence and disorders of the central nervous system［J］.Cell Mol Life Scinece, 1998,54(7):628.

　　［7］ Calvo D, Gomez D, Suarez Y, et al. CD36 is a high affinity receptor for the native lipoproteins HDL, LDL, and VLDL［J］.J Lipid Res,1998,39 (4):777.

　　［8］ Dhaliwal BS, Steinbrecher UP. Scavenger receptors and oxidized low density lipoproteins［J］.Clin Chim Acta, 1999,286(12):191.

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