反相高效液相色谱法测定半枝莲中原儿茶酸的含量

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【摘要】  目的建立半枝莲药材中原儿茶酸的含量测定方法。方法样品用30％的乙醇回流提取，提取液滤过，以反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定。用DiamonsilTM C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.05％磷酸为流动相，流速为1.0 ml·min-1，检测波长为258 nm。结果原儿茶酸的保留时间约为7 min，且与其它峰的分离度大于1.5。原儿茶酸的线性范围为0.018～0.184 μg（r=0.999 8），最低检测限为3 ng，平均回收率和RSD分别为99.7%和0.27%。结论该方法简便快速，结果准确可靠，可为半枝莲药材的质量评价提供有效手段。

【关键词】  反相高效液相色谱法 半枝莲 原儿茶酸 含量测定

　　RP-HPLC Determination of Protocatechuic Acid in Scutellaria barbara

　　Abstract:ObjectiveTo establish a method to determine the content of protocatechuic acid in Scutellaria barbara. MethodsThe sample was extracted with 30% EtOH under reflux, and then the extract solution was filtered. RP-HPLC was used for the determination of protocatechuic acid in Scutellaria barbata. The chromatographic procedure was carried out using DiamonsilTM C18 as an analytic column and a mixture of 25 volume of methanol, 75 volume of 0.05% phosphoric acid as a mobile phase at a flow rate of 1.0 ml·min-1. The detection wavelength was set at 258 nm. ResultsThe peak of protocatechuic acid appeared for about 7 minutes. Resolution of protocatechuic acid was more than 1.5 and its linear range was between 0.018 and 0.184 μg (r=0.999 8).The minimum limit of detection was 3 ng. The average recovery and RSD value of protocatechuic acid were 99.7% and 0.27%, respectively. ConclusionThis method is sensitive and quick and can be used for the quality control of Scutellaria barbara.

　　Key words:RP-HPLC；  Scutellaria barbara；  Protocatechuic acid；  Assay

    半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，其味辛、苦，性寒，清热解毒，化淤利尿。主要用于治疗疔疮肿毒、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌扑伤痛、水肿、黄疸等症［1］。半枝莲中主要含有各种黄酮类成分如野黄芩苷、木犀草素、黄芩素、汉黄芩素等（另文发表）；芳香酸类成分如原儿茶酸及多种萜类、脂肪族化合物和多糖类成分［2］。原儿茶酸对金色葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌等都有明显的抑制作用，并有收敛和促进创面愈合的作用，但迄今为止未见有高效液相色谱法测定半枝莲药材中原儿茶酸含量的文献报道。本文首次采用了RP－HPLC法对其进行了含量测定。本方法简便、快捷，准确可靠，灵敏度高，可用于半枝莲中原儿茶酸的含量测定，为药材的质量控制建立了分析方法。

　　1  仪器与试药

    Waters高效液相色谱仪（美国）：1525泵，2487紫外检测器；Empower工作站；TCQ-250超声波清洗器（北京医疗设备二厂）。

    试剂：甲醇（色谱纯，美国迪马公司），水为二次蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

    原儿茶酸对照品（批号：110809－200503，供含量测定用），半枝莲对照药材（批号：121293－200402）均由中国药品生物制品检定所提供。本文收集了24个不同产地的半枝莲药材样品（经河北医科大学药学院生药学教研室聂凤褆教授鉴定）及半枝莲对照药材。

　　2  方法与结果［3］

　　2.1  色谱条件色谱柱：迪马公司DiamonsilTM C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸；流速：1.0 ml·min-1；检测波长：258 nm；进样量均为20 μl；灵敏度：2.0 AUFS。在以上色谱条件下，样品中原儿茶酸与其它组分的色谱峰分离度良好。见图1。

　　2.2  供试品溶液的制备取本品粉末（过60目筛）约2 g，精密称定，置50 ml圆底烧瓶中，精密加入30%乙醇25 ml，称定重量，回流1 h。放冷，称定重量，用30%乙醇补充减失的量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。　　2.3  对照品贮备液的制备精密称取原儿茶酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.092 mg的溶液，即得。

　　2.4  标准曲线的绘制及线性范围分别精密量取原儿茶酸对照品贮备液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.0 ml，置10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得不同浓度的对照品溶液。分别吸取20 μl注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量X（μg）为横坐标，峰面积（×107）Y为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理得回归方程为：Y＝4.094 6X－0.001 4，r＝0.999 8（n＝6）。原儿茶酸在0.018～0.184 μg范围内线性关系良好。

　　2.5  稳定性实验分别于0，2，4，6，8 ，24 h精密吸取供试品溶液，进样测定，按上述色谱条件测定峰面积。供试品溶液于24 h内，色谱峰面积无明显变化，RSD为0.63%。结果表明在24 h内供试品溶液稳定。

　　2.6  精密度实验精密吸取上述供试品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件测定峰面积。原儿茶酸峰面积的RSD为0.41%，表明该法的精密度良好。

　　2.7  重复性实验取同一批半枝莲药材粉末（过60目筛）约2 g，共6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算含量，其RSD为0.86%，表明该法重现性良好。

　　2.8  最低检测限实验取上述对照品贮备液，逐步稀释，进样，直至信噪比S/N≥3，此时进样量即为最低检测限。原儿茶酸的最低检测限为3 ng。

　　2.9  回收率实验取已知原儿茶酸含量为59.61 μg·g-1的半枝莲药材粉末（过60目筛）约1 g，共6份，精密称定。分别精密量取上述原儿茶酸对照品储备液0.7 ml，加入上述6份药材中，按“2.2”项下方法操作制备供试品溶液。测定其平均回收率为99.7%，RSD为0.27%。可见本方法的准确度高，精密度好，方法可行。

　　2.10  样品测定取24批半枝莲药材粉末（过60目筛）约2 g，精密称定，按“2.2”项下制备供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，然后计算其含量。结果见表1。

　　3  讨论

　　3.1  本文采用HPLC法测定了24批不同产地半枝莲药材中原儿茶酸的含量，该方法简便、快速，准确可靠，灵敏度高，可作为半枝莲中原儿茶酸的含量测定方法，为半枝莲药材的质量控制提供有效手段。

　　3.2  由表1可见，原儿茶酸为不同产地半枝莲的共有成分，产地不同的半枝莲中原儿茶酸含量有较大差别。安徽产半枝莲含量最高，为76.85μg·g-1；湖北产半枝莲含量最低，为12.08 μg·g-1。表1  不同产地半枝莲药材中原儿茶酸的含量（略）

　　3.3  在流动相中分别加入0.1%磷酸、0.05%磷酸和0.1%冰醋酸，比较分离效果。结果发现0.05%磷酸的分离效果最佳，同时克服了加入冰醋酸基线易漂移的缺点。

　　3.4  经HPLC-DVD测定表明在258 nm处原儿茶酸有最大吸收且干扰较少，分离效果良好，与文献报道一致［4］，故选用此波长。
        
　　3.5  本文曾试过超声振荡提取和热乙醇回流法，结果证明热乙醇回流法提取效率高。本文还就不同提取时间（0.5，1，2，3 h），不同醇浓度（30%乙醇，60%乙醇，90%乙醇，25%甲醇，50%甲醇，75%甲醇）分别进行了比较试验，试验结果表明30%乙醇的提取率最高，因此选择了30%乙醇回流1 h作为供试品溶液的制备方法。



【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅱ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：77.

　　［2］肖海涛，李 铣.半枝莲化学成分和药理活性研究进展［J］.中药研究与信息，2005，7（4）：20.

　　［3］张秋海，丁家欣，张 玲. 不同产地与采收季节虎耳草中原儿茶酸的含量测定［J］.现代中药研究与实践，2004，18（4）：30.

　　［4］张来新. 从小蓟中提取原儿茶酸［J］.中医药学报，2004，32（6）：27.