3种石斛药材氢核磁共振谱特征图谱的研究

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      作者：张朝凤 王敏 罗丹 张勉 王峥涛 徐珞珊

【摘要】  目的建立3种石斛药材的氢核磁共振谱（1HNMR）特征图谱。方法首先采用溶剂萃取法或硅胶色谱分离法获得3种石斛（束花石斛D.chrysanthum Wall.,铁皮石斛D. candidum Wall.ex Lindl和金钗石斛D.nobile Lindl.）的特征提取物及其主要成分，然后利用FT-1HNMR（300MHz）技术测定得1HNMR特征图谱并对特征信号进行归属。结果束花石斛、金钗石斛的SCE-B和铁皮石斛的SCEA特征提取物的1HNMR特征图谱可作为该药材基源鉴定的相对标准图谱。结论 建立的1HNMR特征图谱方法在鉴别中药石斛上具有指导意义。

【关键词】  束花石斛 铁皮石斛 金钗石斛 氢核磁共振谱特征图谱

　　Abstract：ObjectiveTo analyse the 1HNMR fingerprints of 3 Dendrobium species.MethodsSolvent extraction and silica gel chromatography were used to separate the chemical constituents of SCE A or B from the stem of 3 Dendrobium species. The characteristic signals of the 1HNMR finger print were ananlysed after determining the structures of the compounds isolated from SCE A or B. Results1HNMR characteristic spectrum of the samples of D. chrysanthum Wall., D. candidum Wall.ex Lindl and D.nobile Lindl. collected from different regions showed highly characteristic features and reproducibility, respectively. ConclusionThe 1HNMR spectrum of SCE A or B from the stem of 3 Dendrobium species can be utilized for its original authentication.

　　Key words：Dendrobium chrysanthum;   D. candidum;   D. nobile;   1HNMR characteristic spectra

    石斛为常用中药，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效。《中国药典》2000年版收载石斛原植物包括环草石斛Dendrobium loddigesii Rolfe，马鞭石斛D. fimbriafum Hook.var.oculatum Hook.，黄草（束花）石斛D. chrysanthum Wall.，铁皮石斛D. candidum Wall.ex Lindl.及金钗石斛D. nobile Lindl.的新鲜或干燥茎。市场上商品石斛原植物（约有30种）来源非常复杂［1，2］，虽对石斛属植物的生药学研究已有很多报道［3，4］，但是，由于某些植物的形态学和组织学特征具有较大的相似性，使得鉴定评价工作仍比较困难。

    国内外学者曾提出用核磁共振波谱法鉴定中药材之真伪［5～8］。其方法学研究的基础来自植物成分特征性和重现性的考察。石斛1HNMR图谱的特征性是指其区别于其他品种的特征信号的组成，其实质是各品种中药所含特征性化学成分或其组成方式不同。石斛属植物中主要含有石斛碱型、四氢吡咯型生物碱、picrotoxane倍半萜、联苄类、菲类等特征性成分［9］。本研究室的前期研究工作已经完成了环草石斛的特征提取物1H-NMR图谱的制定和解析工作。根据化合物的酸碱性、极性大小设定一定的提取物获取程序，对于含有生物碱类化合物的药材主要考察其总生物碱的核磁共振氢谱指纹图谱。本实验是在此基础上，进行3种石斛药材1H-NMR特征图谱的制定及解析工作。

　　1  仪器与材料

    HNMR谱用Burker ACF-300型NMR波谱仪测定,TMS为内标,溶剂采用Cambridge Isotope Laboratories Inc的氘代核磁试剂CDCl3及DMSO-d6。1HNMR谱等的测定温度（探头温度）室温25℃，脉冲宽度8 μs,脉冲延迟时间为6 s，自旋速度20 Hz。扫描次数64。实验所用各石斛属植物样品系采自各产地，经徐珞珊教授鉴定学名，自然干燥，粉碎。见表1。表1  束花、金钗、铁皮石斛的样品（略）

　　2  方法

　　2.1   1HNMR指纹图谱的测定取各生药样品30 g，加95%的EtOH回流提取，按流程［9］获取各样品SCE-A和B ，并测定其1HNMR指纹图谱。

　　2.2  重现性考察中药1HNMR图谱的重现性包含两方面意义，即同基源同来源样品的重现性和同基源不同来源样品的重现性。

　　2.2.1  同基源同来源样品的重现性考察按照特征提取物获取程序［9］，得到特征提取物SCE-A，B，溶解于CDCl3或DMSO-d6，测定3种石斛药材的1HNMR（300 MHz）图谱，考察NMR仪器参数对同一样品测定结果的影响和特征提取物获取程序的重现性。结果表明其同基源同来源样品具有很好的重现性。

　　2.2.2  同基源不同来源样品的重现性考察测定不同采收地3种石斛特征提取物SCE-A、B的1HNMR特征图谱。研究结果表明，①铁皮石斛SCE-A的1HNMR图谱具有很好的重现性；②金钗石斛、束花石斛的特征提取物（总碱SCE-B）的1HNMR图谱具有很好的重现性；而SCE-A的1HNMR图谱的重现性较差。不同来源样品的SCE-A的图谱差异较大。

　　3  结果与讨论

　　3.1  束花石斛由于指纹图谱中的信号是多个化合物信号的叠加，不能逐个予以辨认，但是通过与单体化合物的1HNMR图谱数据相对比可进行大致归属。在对化学成分研究的基础上［10，11］对束花石斛的1HNMR特征图谱的信号进行解析并归属（表2）。由于所含束花石斛生物碱cis-dendrochrysine, trans-dendrochrysine的光谱数据较特殊，在图1中可见d 4.52(m); 6.71(d); 7.68(d); 7.52(m,2H); 7.33(m,2H)这些trans-dendrochrysine的2; 2′;  3′;  2″, 6″和3″, 5″位氢的特征峰信号及d 4.42(m); 6.02 (d); 6.64(d); 7.40(m, 2H); 7.30(m, 2H) 处cis-dendrochrysine中2; 2′; 3′; 2″, 6″和3″, 5″位氢的特征共振信号。表2  不同来源束花石斛SCE-B的1HNMR特征图谱（略）

　　3.2  金钗石斛金钗石斛SCE-B的化学成分研究（《中国药科大学硕士学位论文》）表明其1HNMR特征图谱主要显示石斛碱dendrobine的特征共振信号(图2)，由于该化合物的含量较高，其特征信号在指纹图谱中可得到明确的归属：4.84(dd, J=5.5,3.0Hz), 3.19(t,J=8.5Hz), 2.71(t, J=7.0Hz.), 2.53(s), 2.46(dd, J=4.3, 5.7Hz), 1.41(s), 0.98(d, J=2.9Hz)分别于石斛碱的3位，2位质子，11亚甲基质子，N甲基，5次甲基质子，1位甲基，13和14位2个甲基的1HNMR数据完全一致。不同来源的金钗石斛SCE-B 1HNMR特征图谱信号（CDCL3，300 MHz）见表3。表3  不同来源金钗石斛SCE-B的1HNMR特征图谱数据（略）　3.3  铁皮石斛在铁皮石斛的特征提取物SCE A中分离得到4个化合物，确定化合物为moniliflormin(1), moscatilin(2), 3,4-dihydroxy-4', 5-dimethoxy-bibenzyl (3)和顺式阿魏酸二十八烷基酯(4)，铁皮石斛的1HNMR特征图谱主要表现为联苄类化合物的共振信号，表现为上述化合物1，2，3，4的特征共振信号。具体指认如表4，其中δ 0.88, 1.25, 1.68, 表4  不同来源铁皮石斛SCE A的1HNMR特征图谱（略）

　　4.2处的共振氢信号为顺式阿魏酸二十八烷基酯的特征共振信号; δ2.8处为联苄类化合物α,α′位特征共振信号; δ3.8, 3.7, 3.6处为联苄类化合物甲氧基的特征共振信号, δ6.8处为3,4-dihydroxy-4′，5-dimethoxy-bibenzyl中苯环上3′，5′位质子的特征共振信号。

    1HNMR法在定性鉴别中具有专属性强、快速、准确、灵敏度高等优点，在鉴别植物中药方面的应用上已有报道，但目前应用不多。由于植物中药的组分复杂，其1HNMR指纹图谱的制订和解析均有一定难度。本文探讨了利用1HNMR指纹图谱的方法鉴别中药石斛，在利用NMR法鉴别植物中药上是一个有意义的探索。

    所制订的束花、金钗石斛的生物碱提取部位的1HNMR指纹图谱具有很强的特征性，能够准确地反映其特征性生物碱成分的存在和结构，可作为束花、金钗石斛药材基源鉴定的相对标准图谱；铁皮石斛SCE A的1HNMR指纹图谱有很好的重现性，能够作为其基源鉴定的相对标准图谱。

【参考文献】
  　　［1］吉占和.中国石斛属的初步研究［J］.植物分类学报,1980,18(4):427.

　　［2］张 亮,马国祥,张正行,等.中药石斛质量的化学模式识别［J］.药学学报,1994,29(4):290.

　　［3］徐珞珊,徐国钧,沙文兰,等.中药石斛显微鉴定研究［J］.南京药学院学报,1980,(2):1.

　　［4］ 徐珞珊,徐国钧,林惠蓉,等.中药石斛显微鉴定研究Ⅱ［J］.南京药学院学报,1981,2:52.

　　［5］Rafael Suau, Ana Cuevas, Ana Isabel Garcia. et al.Isoquinoline Alkaloids from Platycapnos［J］.Phytochemistry, 1991,30(10):3315.

　　［6］秦海林,赵天增.核磁共振氢谱鉴别植物中药的研究［J］.药学学报,1999,34(1)：58.

　　［7］秦海林,赵天增，袁卫梅，等.虎杖、何首乌和掌叶大黄、唐古特大黄的1HNMR指纹图谱解析［J］.药学学报, 1999, 34(11)：828.

　　［8］秦海林，张建新，王峥涛，等.环草石斛的1HNMR指纹图谱解析［J］.中国中药杂志，2002，27（12）921.

　　［9］陈晓梅,郭顺星. 石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2001,13(1):70.

　　［10］Li Yang, Chaofeng Zhang, Hong Yang et al. Two new alkaloids from Dendrobiun Chrysanthum［J］.Heterocycles.2005,65(3):633.

　　［11］杨 莉，王 芸，毕志明，等.束花石斛化学成分研究［J］.中国天然药物，2004，2：280.