石榴皮中鞣质和黄酮类化合物抑菌作用的实验研究

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【摘要】  目的探讨石榴皮中鞣质和黄酮类化合物的体外抑菌活性效果并确认其有效部位。方法提取两种化合物，采用试管两倍稀释法对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌进行体外抑菌实验。结果石榴皮中鞣质类化合物对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌均有不同程度的抑菌作用，而黄酮类化合物对绿脓杆菌和白色念珠菌抑菌效果不强。结论石榴皮中鞣质和黄酮类化合物有一定的抑菌作用，且鞣质类化合物呈现广谱抗菌特性，并具有抗耐药菌作用。

【关键词】  石榴皮 鞣质 黄酮 抑菌作用

  　　An Experimental Study on the Antibacterial Activity of the Tannin and Flavonoid in Punica granatum L.

　　　Abstract:ObjectiveTo discuss the antibacterial activity of the tannin and flavonoid in Punica granatum L..Methods The tannin and flavonoid from Punica granatum L. were prepared, and subject to bacteriostatic tests in vitro by test tube continuously in order to observe their minimal in hibitory concentration (MIC) to Staphylococcus aureus, Shigellaf, Salmonella, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans.ResultsThe tannin had antimicrobial activity against the six kinds of bacteria in different degrees, but the flavonoid had little antibacteria effect on Pseudomonas aeruginosa and Candida dlbicans.Conclusion The tannin has broad spectrum of antimicrobial activity and has antimicrobial effect to drug resistance bacteria.

　　Key wordsunica granatum L.;  Tannin;  Flavonoid;  Antibacterial activity

    石榴皮是石榴科植物石榴Punica granatum L.的果皮。石榴皮因有收敛涩肠，清热燥湿等功效，民间常用来治疗多种疾病。大量研究表明，石榴皮对绿脓杆菌、福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌等有抗菌作用，对多种皮肤真菌也有不同程度的抑制作用，还有抗流感病毒的作用［1］。为确认其有效部位，将其所含组分较多的鞣质类和黄酮类化合物提取分离后，进行体外抑菌实验研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  药品石榴皮购于武汉银杏中药饮片厂，经武汉大学药学院张洪教授鉴定为石榴科石榴属石榴Punica granatum L.的果皮。

　　1.2  菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923，福氏痢疾杆菌ATCC8144，沙门氏菌ATCC20020，大肠杆菌ATCC25922，绿脓杆菌ATCC4257，白色念珠菌ATCC0737。以上菌株均由三峡大学护理学院检验教研室鉴定保存。

　　1.3  菌液的制备将试验菌种接种于MH琼脂平板上，37℃培养18 h后，用MH肉汤将菌苔洗下配成细菌悬液，经比浊法判定菌量，配制成1×106CFU/ml菌液。

　　1.4  药物纸片的制备将直径为6 mm的灭菌滤纸片浸透于稀释浓度为100 μg/ml总鞣质和总黄酮提取物药液中，2 h后取出烘干备用。

　　1.5  方法

　　1.5.1  黄酮和鞣质的制备石榴皮粗粉，用70%乙醇超声提取30 min，提取液减压浓缩，水溶液加4%明胶溶液沉淀，抽滤，上清液用醋酸乙酯溶液萃取，醋酸乙酯层减压浓缩至胶状，加适量水溶解，滤去不溶物，清液冷冻干燥得黄酮粉末。而明胶沉淀用50%丙酮水溶液溶解，离心弃去沉淀，丙酮溶液减压浓缩，所得胶状物用水溶解，再用醋酸乙酯萃取，醋酸乙酯层减压浓缩至胶状，加适量水溶解，滤去不溶物，清液冷冻干燥得鞣质粉末。

　　1.5.2  抑菌活性的测定［2］

　　将培养基灭菌后倒入平皿内，每个平皿约20 ml，待培养基凝固后，取已校正浓度的菌液0.2 ml分别涂布培养基表面，制成含菌平板。室温2～5 min后，平铺药物纸片，置37℃恒温箱培养16～18 h后，用卡尺精确测量纸片周围抑菌圈直径的大小，结果以mm表示，以无菌生理盐水作空白对照，测3次求平均值。以上操作均在无菌室内进行。　1.5.3  最低抑菌浓度（MIC）的测定［2］

　　采用两倍稀释法检测药液的MIC，即取12支无菌试管编号，1～11号无菌试管各加入1 ×106 CFU/ml菌液1 ml，取1 ml原药液置于第1号试管中，均匀混合，继而吸取1 ml加入第2号试管内，依次类推稀释至10号管，弃去1 ml，第11号管作为不加药液的阳性对照管，第12号管只加药液1 ml作为不加菌悬液的阴性对照管。稀释后最终浓度为500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.8，3.9，1.95，0.98 μg/ml的药液用于测定MIC，将各试管摇匀后置于37℃的恒温箱中培养24 h后观察结果。

　　2  结果

　　2.1  鞣质和黄酮的抑菌活性结果见表1。表1  抑菌实验结果（略）

　　2.2  鞣质和黄酮的体外抑菌实验结果见表2～3。表2  鞣质的体外抑菌实验结果（略）表3  黄酮的体外抑菌实验结果（略）

　　3  讨论

    实验结果表明，石榴皮中的鞣质类和黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌均有明显的抑菌作用，鞣质类化合物对以上四种细菌的作用更加敏感，由此初步判断石榴皮抗菌消炎，治疗肠炎、痢疾的有效部位应属此两类化合物。

    绿脓杆菌在我国烧伤病人中的感染率多年来占据第1位，且易出现多重耐药性［3,4］。石榴皮中鞣质类化合物对绿脓杆菌的抑菌圈为15 mm，且MIC为31.20 μg/ml，而黄酮类化合物对绿脓杆菌没有抑菌活性，说明石榴皮治疗水火烫伤导致感染的有效部位应属鞣质类化合物。

    白色念珠菌为天然耐药菌，对大量长期应用抗生素和久治不愈的重症感染者具有很大的威胁［5］。绿脓杆菌为医院感染常见的病原菌，可对多种抗生素产生耐药性［6,7］。石榴皮中鞣质类化合物对白色念珠菌和绿脓杆菌的抑菌圈均≥10 mm，且MIC分别为62.50和31.20 μg/ml，呈现出一定的抑菌活性，而黄酮类化合物对这两种细菌没有抑菌作用或抑菌作用不强，由此可初步判断石榴皮中鞣质类化合物具有抗耐药菌作用，且呈现广谱抗菌特性。

    通过对石榴皮中黄酮和鞣质抑菌实验结果判断，其结果可作为药效学的初步判断依据。天然药物有效成分的确认对中药现代化、新药的开发研究意义重大，本实验基于此前提进行了初步研究，以供参考。

【参考文献】
  　　［1］王选东，刘利林，许宗远.正交设计研究石榴皮总黄酮提取工艺［J］.塔里木农垦大学学报,2003,15(2):11.

　　［2］李仪奎.中药药理实验方法学［M］.上海：上海科学技术出版社，1991：286.

　　［3］郭振荣，高维宜.几种绿脓杆菌药物疗效筛选的实验研究［J］.中华整形烧伤外科杂志，1995，11（6）：421.

　　［4］贾赤玉.对20株铜绿单胞菌多重耐药性基因定位的初步研究［J］.中华整形烧伤外科杂志，1995，11（5）：330.

　　［5］陈林娜，周力勤.中药对临床耐药菌株的体外抑菌试验观察［J］.中华医院感染学杂志，2005，15（1）：118.

　　［6］余加林，吴仕孝.新生儿感染病原菌及药敏实验12年总结［J］.中华儿科杂志，2001，39（6）：354.

　　［7］吴 蓉，府伟灵.重庆地区铜绿假单胞菌感染及耐药性分析［J］.中华医院感染学杂志，2004，14（1）：97.