鹿藿醇提取物的体外杀精及抗菌作用

amy54321 · 发表于 2014-8-19 22:04:17

【摘要】  目的研究鹿藿醇提取物的体外杀精及抗菌作用。方法（1）鹿藿醇提取物按照国际计划生育基金会认可的杀精子实验方法，对10只小鼠附睾精子悬液和10例人精液进行体外杀精实验。（2）用试管法及琼脂平皿稀释法观察鹿藿醇提取物对几种临床常见致病菌的体外抑菌作用。结果鹿藿醇提取物对小鼠和人精子最低杀精浓度分别为50和100 mg/ml；对标准菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌MIC（试管法）分别为1.0，1.0，4.0，4.0 mg/ml。对临床分离菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌MIC（试管法）分别为0.5，2.0，8.0 mg/ml。结论鹿藿醇提取物对小鼠和人精子有一定杀精作用，对临床常见致病菌有比较强的抗菌作用。

【关键词】  鹿藿醇提取物体外杀精抗菌作用

　　Study on the Spermicidal and Antibacterial Effect of Ethanol Extract of Rhynchosia volubilis Lour roots in vitro

　　WANG Jiangang, XIONG Chengliang,WANG Xueting,GUO Xianfeng,LI Yan,WANG Juanrui

　　1.Family Planning Research Institute, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China；

　　2.Department of Pharmacology, Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China

　　Abstract：ObjectiveTo study  the spermicidal and antibacterial effect of ethanol extract of Rhynchosia volubilis Lour roots. MethodsEthanol extract of  Rhynchosia volubilis Lour roots was applied in vitro in spermicidal tests with 10 mouse sperm samples and 10 human sperm samples. The antibacterial effects of ethanol extract of Rhynchosia volubilis Lour roots on staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, and pneumobacillus were observed. ResultsThe lowest spermicidal concentration of ethanol extract of Rhynchosia volubilis Lour roots on mouse and human sperm were 50mg/ml and 100mg/ml, respectively.The lowest inhibiting concentration(MIC，tube testing method) of  ethanol extract of Rhynchosia volubilis Lour roots on staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, and pneumobacillus were 1.0，1.0，4.0，4.0 mg/ml，respectively.ConclusionThe ethanol extract of Rhynchosia volubilis Lour roots has spermicidal and antibacterial effect.

　　Key words：Ethanol extract of Rhynchosia volubilis Lour roots;  Spermicide in vitro; Antibacterial effect

鹿藿Rhynchosia volubilis Lour又称鹿豆、野绿豆、老鼠眼等。其功能消积散结，消肿止痛，舒筋活络。用于小儿疳积，牙痛，神经性头痛，颈淋巴结结核，风湿关节炎，腰肌劳损；外用治痈疖肿毒，蛇咬伤等［1］。徐惠敏、丁钉生等［2，3］用鹿藿根水煎液经过初步研究，发现有体外杀精及抗菌作用。本实验进一步探讨鹿藿乙醇提取物的抗菌及体外杀精作用，为其作为阴道杀精剂提供实验依据。

　　1  材料

　　1.1  药物

　　鹿藿根购于湖北京山县，由中科院武汉植物所专家鉴定。6.2 kg鹿藿根晾干，粉碎，70%乙醇溶液浸泡7 d，乙醇提取液用旋转蒸发仪进行减压蒸馏(T：50℃，P：-0.09 MPa)制得乙醇浸膏0.48 kg，冷藏备用。壬苯醇醚（NP-9），北京中惠制药厂生产，批号：000505。

　　1.2  精液来源

　　1.2.1  动物精液

　　KM雄性小鼠10只，体重（26.3±4.5）g , 由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供(SCXK鄂2004-0007）。颈椎脱臼处死，取附睾置无菌小烧杯中，生理盐水清洗，加入精子营养液（Tyrode），剪开附睾尾部，37℃孵育10 min，检查精子活动并计数，用精子营养液稀释到精子数为107/ml，置37℃水浴中待用。

　　1.2.2  人精液

　　年龄30～40岁健康男性自愿献精者10例，禁欲3～5 d，手淫法取精液。37℃液化30 min，精子计数不低于50×106/ml，活率>70%。

　　1.3  菌株

　　标准菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、大肠埃希菌（ ATCC8099）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；肺炎克雷伯菌（ATCC13883）购于卫生部临床检验中心（北京万泰生物药业有限公司）。分离菌株由河南科技大学第一附属医院检验科细菌室分离并鉴定。金黄色葡萄球菌（对阿奇霉素、氨灭菌、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、四环素、氨苄西林、氯霉素、苯唑西林、复方新诺明、青霉素、头孢噻肟、头孢吡肟耐药）、铜绿假单胞菌（对头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、氨曲南、氯霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、氨苄青霉素、阿米卡星、复方新诺明耐药）、大肠埃希菌（阿奇霉素、氨灭菌、四环素、氨苄西林、氯霉素、苯唑西林、复方新诺明、青霉素、头孢噻肟、头孢吡肟耐药)。

　　2  方法

　　2.1  体外杀精实验

　　根据国际计划生育联盟标准方法略加改进［4］。将准备好的精液50 μl加入鹿藿根乙醇提取物不同浓度的药液中，即刻混匀。迅速取一滴于载玻片上，室温（28±2）℃下，连续观察5个高倍镜视野，以全部精子失活为终点，测出药物2min内杀精子情况。每次均采用不同浓度的壬苯醇醚溶液（0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125 mg/ml）及生理盐水为对照，每份标本重复测3次。

　　2.2 体外抑菌实验

　　2.2.1  菌液的制备

　　取形态相同的菌落数个接种于培养管内，36℃，4～6 h 后纠正浓度，使其混浊度相当于0.5麦氏比浊管，约为1.5×108CFU/ml，立即用于实验。　2.2.2  最低抑菌浓度（MIC）测定方法参照《全国临床检验操作规程》关于最低抑菌浓度的检测方法用胨水或琼脂将药物配成所需浓度［5］。琼脂平皿稀释法：选用直径为10 cm的玻璃平皿，按表1添加含鹿藿根乙醇提取物的培养基。用微量加样器接种，每个平皿接种7种菌，每个接种点接种20 μl稀释好的菌液，形成一个直径为8～10 μm的小液滴，最终接种菌量约每个接种点含107个菌。放置10 min，待菌液稍干后倒置放入37℃恒温培养箱培养24 h，观察结果。以培养皿上菌落生长完全被抑制的最低药物浓度为鹿藿根乙醇提取物对该菌的MIC。表1  琼脂稀释法配方（略）

试管法：每组排列无菌试管13只，于第2～12号管内放相应培养基2 ml，取制备好的药液分别加入2 ml1号2号管，第2管混匀后取2 ml加入第3号管，如此依次对倍稀释至第10号管，吸出2 ml弃去。这样第1～10号管内含药液浓度倍量稀释，浓度分别为每毫升含药 64，32 ，16 ，8，6，4，2，1，0.5，0.25 mg，第11和第12号管内为无菌培养基，第13号管内加入1∶25的84消毒液2 ml，作为阳性对照。除第11号管外，每管内接种菌液100 μl，37℃恒温摇床震荡24 h观察结果。肉眼未见细菌生长的最低药物浓度为鹿藿乙醇提取物对该菌的MIC。

　　3  结果

　　3.1  体外杀精实验鹿藿乙醇提取物对小鼠和人精子的杀灭作用见表2。表2  鹿藿乙醇提取物对小鼠和人精子的杀灭作用（略）

　　3.2  体外抑菌实验鹿藿乙醇提取物对常见致病菌的最低抑菌浓度见表3。表3  鹿藿乙醇提取物对常见致病菌的最低抑菌浓度（略）

　　2.14.0临床分离菌株

　　金黄色葡萄球菌2.10.5大肠埃希菌 16.7 8.0铜绿假单胞菌 2.12.0

　　4  讨论

从实验结果得知，鹿藿乙醇提取物无论对小鼠还是对人均有杀精作用，不仅如此，鹿藿乙醇提取物还有抗菌及抗支原体、衣原体的作用［6］，尤其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的作用较强。虽然对大肠杆菌作用较弱，但在杀精时的用量也可显示很强的抗菌作用。阴道杀精剂具有使用简便、安全、有效，在计划生育用药研究方面占据重要位置。壬苯醇醚是一个作用很强的典型阴道杀精剂。但是，近年来对壬苯醇醚的对照研究已经揭示，此药不仅不能预防主要性传染疾病和艾滋病毒感染，且长期使用反而还会提高经由性交所致传染疾病的风险［7～9］。目前性传播疾病发病率不断上升，有关性传播疾病发病率预防措施的研究越来越引起各国学者的关注［10，11］。如果阴道杀精剂同时具有抗微生物及某些性传播疾病的作用又起到杀精抗菌作用应该有比较广泛的市场。鹿藿杀精又抗菌的特性，为其应用奠定了基础。鹿藿醇提物所含成分较多，有必要对其进一步的分离及对杀精抗菌作用进行进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］.北京：人民卫生出版社, 1975：527.

　　［2］徐惠敏，胡廉，熊承良.中药鹿藿的抑菌实验研究［J］. 天然产物研究与开发，2006，18（3）：435.

　　［3］丁钉生，徐惠敏，胡廉，等. 中药鹿藿的体外抑精实验研究［J］.中国临床实用医学杂志，2006，1（4）：1.

　　［4］WHO.人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册，第4版［M］.北京：人民卫生出版社，2001：51.

　　［5］叶应妩.全国临床检验操作规程［M］. 南京：东南大学出版社，1990：465

　　［6］卫海,王建刚，熊承良.中药鹿藿及其提取物对解脲脲原体国际标准株的抑菌实验研究［D］.武汉：华中科技大学同济医学院，2006：20.

　　［7］刘宏本.具有杀精子作用的杀微生物药物研究进展［J］.上海医药，2003，24（2）：79.

　　［8］Roddy RE,Zekeng L, Ryan KA, et al.Effect of nonoxynol-9 Gel on urogential gonorrhea and chlamydial infection: A randomized control trial［J］.JAMA,2002,287(9):1117.

　　［9］Roddy RE,Zekeng L, Ryan KA, et al. A controlled trial of nonoxynol-9 film to reduce male -to -female transmission of sexually transmitted diseases［J］.N Engl J Med,1998,399(8):504.

　　［10］Chantler E. Vaginal spermicides［J］.Br J Family Planning, 1992,17(1)：118.

　　［11］伏晓敏，励千里，金爱华.氯已定醋酸盐的体外杀精效果及抑菌作用的研究［J］.中国现代应用药学杂志，2003,20(2)：97.

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