固金方抑制裸鼠移植瘤生长及肿瘤血管生成的实验研究

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【关键词】  固金方 Lewis肺癌细胞 微血管密度 血管内皮生长因子

    恶性肿瘤的生长和转移有赖于瘤体内血管的形成，抗肿瘤血管生成治疗日益成为人们研究的重点。固金方是我们临床上多年来治疗呼吸道肿瘤的有效方剂，配合化疗具有增强免疫力，减毒增效的作用［1］。我们在前期工作的基础上，对其作用机理进行探讨，本实验重点观测固金方对Lewis肺癌细胞生长及其血管生成的影响。

　　1  材料

　　1.1  动物昆明种雌性裸小鼠，体重18～22g，由河北医科大学实验动物中心提供。

　　1.2  用药固金方，购自河北省中医院，并经医大中药系鉴定。环磷酰胺0.2 g/支，上海华联公司产品，批号：01014。

　　1.3  瘤细胞株Lewis肺癌细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所。

　　1.4  试剂及仪器CD34单抗及免疫试剂盒，购自北京中山生物技术公司；德国Leica切片机；CS-B型摊片烤片机；ACS-EAS电子天平（上海天平仪器厂生产）。

　　2  方法

　　2.1  移植瘤动物模型制备瘤种细胞株从冻存的液氮内取出，复苏后分别接种于小鼠左后肢皮下，接种后7～10 d，选择肿瘤生长旺盛且无破溃的动物，颈椎脱臼致死，固定于板上，消毒操作部位皮肤后切开，用无菌玻璃匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水适量稀释成1∶3～1∶4的瘤细胞混悬液，每只鼠种0.2 ml接种于右前肢腋窝下，整个接种时间在30 min内完成。

　　2.2  动物分组及给药接种后随机分成4组，每组10只。①模型组：每只灌胃0.2 ml生理盐水，1次/d；②对照组：环磷酰胺按20 mg/kg腹腔注射，1次/d；③固金方组：按12.5 g/kg（稀释为每毫升含药1.25 g，相当于成人剂量10倍）灌胃，1次/d；④固金方加环磷酰胺组（简称“联合组”）：每日分别灌胃固金方（剂量同固金方组）及腹腔注射环磷酰胺（剂量同对照组）。灌胃开始于接种后第2天，各组用药时间均为6周。

　　2.3  观察项目及检查方法接种给药6周后处死动物。观察下列项目：

　　2.3.1  瘤体积、瘤重用游标卡尺测量瘤体长径和短径，计算瘤体积，瘤体积=Ⅱab2/d（a长径，b短径）绘制增殖曲线。肿瘤抑制率=（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。

　　2.3.2  MVD检测实验终末小鼠死亡时将肿瘤组织剥离，甲醛固定，石蜡埋切片, SP法进行CD34免疫组化染色。结果判定：任何胞浆内染成棕色的内皮细胞或内皮细胞团，均按独立的微血管计数。计数时先于低倍镜下选择癌灶浸润最明显处，然后在200倍镜下计数5个视野内微血管数目，取其平均值做为MVD。

　　2.3.3  肿瘤组织血管内皮生长因子（VEGF）mRNA半定量分析采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术。①组织总RNA摄取；②RNA鉴定和定量；③CDNA合成、PCR扩增。VEGF引物序列为：上游5′-TGTGCTGGCCTTGGTGAGGT-3′，下游5′-TGTGCTGGCCTTGGTGAGGT-3′；β-actin引物序列为：上游5′-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3′，下游5′-TTGCGCTCAGGAAGGAGCAAT-3′。取PCR产物电泳，对电泳条带进行吸度峰值下面积积分，将VEGF（β-actin×100）作为VEGF mRNA表达水平的相对参数。　2.4  统计学分析

　　应用SPSS 11.0统计分析软件进行统计学分析。

　　3  结果

　　3.1  不同治疗对肿瘤的抑制作用在实验过程中发现，联合组、固金方组、对照组接种后移植瘤出现较模型组晚约1周，且固金方组有一动物直到接种后25 d，即中药治疗24 d才出现肉眼可见的肿瘤生长，联合组则有一动物直到实验结束尚未见肿瘤生长，而模型组无此现象。为了排除接种失败，我们所有的实验结果均剔除此2例。按固金方组、联合组分别为9个动物，进行统计分析。从表1可以看出：对照组、固金方组、联合组的移植瘤体积、瘤重均明显小于模型组。固金方组抑瘤率虽略低于对照组，但经统计学分析无显著性差异（P＞0.05）。联合组抑瘤率明显提高（P＜0.05），这些结果表明固金方有与环磷酰胺相似的抑瘤效果，两者联合抑瘤效果明显提高。表1  不同治疗对肿瘤的抑制作用（略）

　　3.2  各组小鼠肿瘤组织MVD表达比较各组荷瘤鼠肿瘤组织中均检测到MVD的表达，其表达水平分别为：模型组（31.96±4.24）；对照组（15.11±3.55）；固金方组（14.98±3.01）；联合组（7.13±1.65）。与模型组相比，对照组、固金方组、联合组肿瘤组织MVD表达均明显下降（P＜0.05）；与对照组比较，固金方组MVD表达；差异无显著性（P＞0.05）；与对照组、固金方组比较，联合组MVD表达下降更多（P＜0.05）。

　　3.3  各组小鼠肿瘤组织中VEGF mRNA表达量的测定提取的总RNA经2%琼脂糖凝胶电泳后（每一样品均出现清晰的28S和18S带条）。各组肿瘤组织β-actin mRNAPCR产物电泳各带明暗、宽窄均匀一致，而各组肿瘤组织的VEGF mRNAPCR产物电泳则显色不均一。与模型组比，对照组、固金方组、联合组肿瘤组织VEGFmRNA表达量均明显下降（P＜0.05）；与对照组比较，固金方组VEGFmRNA表达量虽有下降的趋势，但未明显差异（P＞0.05）；与对照组、固金方组比较，联合组VEGFmRNA表达量表达下降更多（P＜0.05）。各组小鼠肿瘤组织VEGFmRNA的表达见表2。表2  RT-PCR-方法各组小鼠肿瘤组织VEGFmRNA的表达比较(略)

　　4  讨论

    转移是恶性肿瘤的基本生物学行为，也是临床肿瘤治疗失败的主要原因，目前认为，在肿瘤侵袭转移过程中，最关键的是肿瘤微血管和淋巴管的生成，相关研究正成为肿瘤研究的一个热点。血管内皮生长因子（VEGF）是促进肿瘤微血管生成的重要因子，同时也是一种血管通透性诱导因子，可增加微血管特别是毛细血管后静脉和小静脉的通透性，是已知最强的血管通透剂，其与肿瘤新生血管的形成和血行转移的关系已得到了广泛证实，是肿瘤微血管生成和侵袭转移的关键因素。近期国内外文献报道［2］，多种细胞毒化疗药物在体内外实验中显示出抗血管生成活性，这些药物如环磷酰胺，紫杉醇、长春花碱等，KlementG等［3］的近期实验显示活性增殖的内皮细胞较增殖肿瘤细胞对化疗药物更敏感，将这样低浓度的化疗药物长期持续使用，避免了常规化疗方案中内皮细胞在化疗间歇期的恢复，增加了其抗血管生成效果，起到了抑制肿瘤细胞的作用。因此，国外将这种连续的规律的低剂量化疗称为抗血管生成化疗。本实验应用连续环磷酰胺治疗荷瘤小鼠，检测到MVD，VEGF表达水平较模型组下降，证实了环磷酰胺持续的给药计划的抗血管生成作用。多位学者［4～6］研究证实，部分中药提取的有效成分可以抑制肿瘤血管生成，如中药薏苡仁提取脂溶性抗癌化合物-康莱特注射液，人参提取物-人参皂苷Rg3，其抗肿瘤的作用机制之一即与抑制肿瘤血管生成有关。固金方是中药复方，其成分复杂，从我们的研究可以看到，与模型组相比，瘤体积、瘤重量均受到抑制，瘤组织内在MVD，VEGF表达下降；与化疗药合用时其抑制作用更加明显，提示其抑瘤的作用机理可能与下调MVD，VEGF的表达有关。



【参考文献】
  　　［1］胡冬菊，杨 倩，刘经选.加味百合固金方对局部晚期肺癌化疗减毒增效作用临床观察［J］.新中医，2007，13（1）：327.

　　［2］Gately S,kerbel R,Antiangiogenic sheduling of close cancer chemotherapy Cancer 2001，7(9)：427.

　　［3］Klement G,Huang P,MayerB,etal.Differences in therapeutic indexes of combination nutronomic chemotherapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidrug-resistant human breast cancer xenografts［J］. Clin Cancer Res 2002;8(1)：221.

　　［4］张 良.康莱特注射液对血管生成的影响［J］.临床肿瘤杂志，2000，20(4)：313.

　　［5］潘小民，叶大凤，谢 幸，等.人参皂苷Rg3对药卵巢癌的严重联合免疫缺陷鼠的抗肿瘤血管生成作用的研究［J］.中华妇产科杂志，2002，37(4)：227.

　　［6］高 勇，王生军，许 青，等.人参皂甙Rg3抑制肿瘤新生血管生成形成机制研究［J］.肿瘤防治研究，2001，28(3)：179.